一种酶能在10小时内分解90%的塑料

目前的估计表明，在全球每年生产的3.59亿吨塑料中，有11.5亿-2亿吨积累在垃圾填埋场或自然环境中2.聚对苯二甲酸乙二酯(PET)是最丰富的聚酯塑料，全世界每年生产近7000万吨用于纺织品和包装3.PET的主要回收工艺通过热机械手段导致机械性能的损失4.因此，首选从头合成，PET废物继续积累。PET是一种极难水解的聚酯，具有很高的芳香族对苯二甲酸酯单元比率(这降低了链的流动性)。已经报道了几种PET水解酶，但生产率有限6，7。在这里，我们描述了一种改进的PET水解酶，它在10个小时内最终实现了至少90%的PET解聚为单体，生产率为每升每升16.7克对苯二甲酸盐(每公斤PET悬浮液200微克，酶浓度为每克3毫克)。在这里，我们描述了一种改进的PET水解酶，它最终在10个小时内至少实现了90%的PET解聚为单体，生产率为每升16.7克(每公斤PET悬浮液200微克，酶浓度为每克3毫克。这种高效、优化的酶的性能超过了迄今报道的所有PET水解酶，包括来自Ideonella sakaiensis菌株201-F6的酶8、9(甚至在辅酶10的辅助下)以及最近引起人们兴趣的相关改良变异体11、12、13、14。我们还表明，生物回收PET表现出与石化PET相同的特性，可以从酶解聚的PET废料中生产出来，然后再加工成瓶子，从而为循环PET经济的概念做出贡献。

作者声明，所有支持本研究结果的数据均可在文章、其扩展数据、其源数据中获得，或在合理要求下从相应作者处获得。所报道结构的原子坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库中，登录号分别为LCC-S165A的6THS和ICCG-S165A的6THT。

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我们感谢图卢兹生物技术研究所(TBI)的iCEO设施，这是图卢兹综合筛选平台(PICT，IBiSA)的一部分，感谢它提供进入超高效液相色谱(UHPLC)和蛋白质纯化设备的通道；感谢图卢兹怀特生物技术公司(TWB，UMS INRAE 1337/UMS CNRS 3582)提供进入微型生物反应器的通道。我们感谢Carbios(法国圣博泽尔)、CRITT Bio-Industries(法国图卢兹)、Pivert(法国维内特)和LEITAT技术中心(西班牙巴塞罗那)为提纯对苯二甲酸以及PET和瓶子生产所做的贡献。我们还感谢药理和结构生物学研究所(IPBS，法国图卢兹)的结构生物物理小组进入结晶设施，以及ALBA(西班牙巴塞罗那)和ESRF(法国格勒诺布尔)同步加速器进行数据收集。我们还承认在Occigen(CINES，法国蒙彼利埃)和Curie(TGCC，巴黎-萨克雷，法国)超级计算机以及Région Midi-Pyrénées计算中间中心(CALMIP，法国图卢兹)上使用高性能计算资源。这项研究得到了松露资本(P.Pouletty)和一项科学研究赠款的支持(THANAPLAST项目，OSEO ISI合同编号I 1206040W)。

例如，M.D.、M.Chado和A.M.都是Carbios的员工。V.T.自2019年1月以来一直是Carbios的员工。C.M.T.、H.T.、V.T.、M.L.D.、S.D.、I.A.、S.B.和A.M.已提交专利WO2018/011284和WO2018/011281，专利名称为“新型酯酶及其用途”。H.T.，M.L.D.，S.D.，A.M.，M.D.和M.Chado已经提交了专利WO2017/198786，“降解塑料产品的工艺”，以保护这里描述的部分工作。保密协议阻止他们披露任何新提交的发明声明。所有其他作者声明没有竞争利益。

A，这里使用的酶，据报道可以水解PET 8，16，23，36，37。熔化温度(Tm)由DSF评估；数值对应于平均值C±S·D。(n=3)。B、在不同温度下，用等摩尔量的纯化的IS-PETase、FSC、BTa-水解酶1、BTa-水解酶2或LCC(6.9nmol蛋白g PET−1和2 g PET−1)水解无定形GF-PET。获得的最高具体活动为粗体。还显示了LCC对PF-PET的比活性。指的是1µs±1S.D.。(n=3)被标明；N.D.，未确定。

野生型LCC对PET的解聚不受水解产物的影响。这些图表比较了在65 °C有或没有进一步添加乙二醇(EG；根据对苯二甲酸当量的量(TA等式)计算的产率(百分比))下PF-PET的解聚动力学。在反应过程中释放的乙二醇)，以及是否进一步添加TA(根据反应过程中释放的乙二醇的量计算得到的产率)。反应引发时EG或TA的加入量相当于100%PET解聚时释放出的产物量。每个符号显示平均值为1µs±1S.D.。(n=3)。LCC的热稳定性是影响PET解聚产率的一个限制因素。在65 °C(空钻石)下反应3天后，加入100g非晶态PF-PET，与野生型液晶显示器(填充钻石)的解聚动力学相比，无明显变化。然而，在65 °C下反应3天后，加入0.69nmol的野生型LCC，重新启动之前停止的分析(填充圈)，其比活性与最初测定的相同(如表中所示)。每个符号代表一个平均数：±0.D。(n=3)；n.a.，不适用；n.d.，未确定。

饱和结果的Boxlot分布。我们通过半纯化的方法生产了209个突变体，并在相同的PF-PET解聚条件下测定了它们相对于野生型LCC的比活性百分比。Q1和Q3分别对应于分布的第一和第三四分位数。中值显示为红线。B，比较野生型LCC和本文所用变异体的比活度和熔融温度。通过制备性生产酶，然后进行PF-PET解聚试验(见补充方法[1])进行实验。指的是1µs±1S.D.。(n=3)如图所示。

根据野生型LCC(实线)和D238C/S283C变异体(虚线)在0、1和100 mM二硫苏糖醇(DTT)存在下的DSF热变性曲线计算了一阶导数。一阶导数峰对应于蛋白质的熔融温度。每条曲线代表三重测试。随着DTT浓度的增加，二硫键减少，导致蛋白质热稳定性降低。灰色加亮表示具有0、1或2个形成的二硫键的种群。较低的DTT浓度(蓝色曲线)不足以完全减少所有的二硫键，导致具有中等熔点的蛋白质的混合群体。RFU，相对荧光单位。

在72 °C或75 °C时，温度对液晶变体F243I/D238C/S283C/Y127G解聚的影响；b，在72 °C时，液晶型变体F243I/D238C/S283C/Y127G在1 mg酶g PET−1、2 mg酶g PET−1或3下，温度对PCW-PET解聚的影响；b、温度对液晶盒变异体F243I/D238C/S283C/Y127G解聚的影响。比较了野生型LCC和变异型LCC在微型生物反应器中PCW-PET解聚的检测结果。前两列显示了PCW-PET解聚过程中使用的参数(温度和酶浓度)。接下来的四列显示了根据NaOH消耗量、EG产量、TA eq计算的解聚产率(24小时后)。生产的，或残留PET的重量。最后一列表示根据NaOH消耗计算出的反应初始速率。

在65 °C、70 °C、72 °C和75 °C条件下，聚酯纤维的结晶度水平发生了变化。

A，左侧，野生型LCC(PdB ID 4EB0；绿色)和催化无活性变体S165A(青色)重叠(在214Cα原子上的均方根偏差为0.25A)。催化残留物用洋红棒表示。右边的特写镜头集中在催化丝氨酸(S165)和邻近残基上。还示出了无偏复合省略图(灰色网格，2F o和−，Fc)，在残基164-166周围在2.0σ等高线。S165A突变在结构上不影响蛋白质在该位置附近的折叠。此外，失活的酶更容易结晶并产生更高质量的晶体，因此我们将S165A突变引入到我们最有效的LCC变异体，即F243I/D238C/S283C/Y127G(ICCG)。B，野生型LCC(PdB ID 4EB0；绿色)和ICCG变异体的催化失活S165A突变体(Tan)重叠在一起(RMSD=220Cα原子上的RMSD=40.27°)。催化残基(品红)和突变残基(棕褐色)用棒表示。特写镜头显示了不同的突变及其周围的残基。与ICCG变体相比，野生型LCC的残基被表示为更细的棒。无偏合成省略贴图(灰色网格，2 F o−和F c)在1.5σ等高线显示。引入的Y127G、S165A、F243I和D238C-S283C(工程二硫桥)突变均不影响LCC的整体结构。标有星号的特写镜头显示，观察到标记为构象a和b的半胱氨酸残基的不同构象。

A，比较蛋白质骨架的灵活性，使用沿着载脂蛋白构象中酶的分子动力学模拟计算的每个残基的Cα原子的平均均方根波动。RMSF与晶体B因子(B)的链接如下：\(\text{rmsf}=\surd\Left(\frac{3B}{8{\pi}^{2}}\right)\)。红色箭头，β-链；黑色矩形，α-螺旋；黄色矩形，野生型液晶晶体结构中的环(PDBID4EB0)；虚线，催化残基的位置。b，监测关键的催化原子间距离，该距离表征了在与模型底物2-HE(MHET)3的复合物中酶的分子动力学模拟过程中发生的催化事件。右侧是催化三联体(残基S165(Ser165)、H242(His 242)和D210(Asp 210))和2-HE(MHET)3的表示，突出显示了三个相关的原子间距离(d1、d2、d3)。这三张图显示了这三个距离在野生型和IC分子动力学模拟的前30秒内的分布