一种中和人抗体与SARS-CoV-2刺突蛋白结合

针对SARS-CoV-2的治疗药物开发可以通过抗原表位的分布来指导，不仅在Spike(S)蛋白的受体结合域(RBD)上，而且在整个Spike(S)蛋白上也是如此。我们从10例新冠肺炎恢复期患者中分离并鉴定了单克隆抗体。3株mAb对正品SARS-CoV-2具有中和活性。一种命名为4A8的mAb对真和假型SARS-CoV-2都有很高的中和效力，但不与RBD结合。我们通过测定4A8与S蛋白复合物的冷冻EM结构，将4A8的表位定义为S蛋白的N末端结构域(NTD)，4A8-NTD界面的总分辨率为3.1埃，局部分辨率为3.3埃。这表明NTD是针对新冠肺炎的治疗性mAb的一个有前途的靶点。

新冠肺炎的全球暴发已成为对人类健康的严重威胁(1-3)。新冠肺炎是由一种新型冠状病毒--严重急性呼吸综合征冠状病毒2型引起的，该病毒是一种包膜的正链核糖核酸病毒，可导致人类出现咳嗽、头痛、呼吸困难、肌肉痛、发烧和严重肺炎等症状(1，3-5)。

SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，还包括2002年和2012年分别引起疫情的SARS-CoV和MERS-CoV(6、7)。SARS-CoV-2与SARS-CoV有大约80%的序列同源性，并使用相同的细胞受体，血管紧张素转换酶2(ACE2)(8-16)。

三聚体S蛋白修饰冠状病毒表面，在病毒侵入过程中起关键作用(17，18)。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶如TMPRSS2(18，19)切割成N端S1亚基和C端S2亚基，并从融合前改变为融合后状态(20)。S1和S2分别由胞外区(ECD，1-1208个氨基酸)和单个跨膜螺旋和介导受体结合和膜融合(16)组成。S1由N-末端结构域(NTD)和受体结合域(RBD)组成，在决定组织嗜性和宿主范围(21，22)中起着关键作用。RBD负责与ACE2结合，而NTD的功能尚不清楚。在一些冠状病毒中，NTD可能在最初附着时识别特定的糖份，并可能在S蛋白从融合前到融合后的转变(23-26)中发挥重要作用。MERS冠状病毒S蛋白的NTD可作为中和抗体的关键表位(26)。

针对SARS-CoV-2S蛋白的单克隆抗体(MAb)具有很强的中和活性，是新冠肺炎(27-29)治疗干预研究的重点。许多研究报道了针对RBD的SARS-CoV-2中和抗体的功能和结构，并抑制S蛋白和ACE2之间的结合(28-34)。单独应用RBD靶向抗体可能会在病毒中诱导抗药性突变(26)。针对非RBD表位的抗体可能被添加到SARS-CoV-2的抗体鸡尾酒疗法中。因此，我们试图鉴定针对S蛋白不同区域和针对核衣壳(N)蛋白的抗体。

为了分离单克隆抗体并分析SARS-CoV-2的体液抗体反应，我们收集了10例SARS-CoV-2感染康复患者的血浆和外周血单核细胞(PBMC)。捐赠者的年龄从25岁到53岁不等。从疾病确认日到采血日，患者1-5的间隔时间为23-29天，患者6-10的间隔时间为10-15天(表S1)。我们对SARS-CoV-2S蛋白的不同片段(包括完整的ECD、S1、S2和RBD)和核衣壳蛋白(N)的血浆结合抗体效价进行了测定。除供体2外，所有患者的血浆都与全部5个SARS-CoV-2蛋白片段结合，而供体2的血浆仅识别S-ECD和S2(图1A)。血浆对正品SARS-CoV-2和HIV载体的假型SARS-CoV-2的中和能力是相关的(r=0.6868，p<；0.05)(图1B)。这些结果表明，这10例患者在自然感染SARS-CoV-2期间均特异性地诱发了体液免疫应答。

为了分离S蛋白特异性单克隆抗体，我们首先以S-ECD为探针，用流式细胞术从恢复期患者1-5的外周血单个核细胞(PBMC)中分选IgG+记忆性B细胞(图1C)。荧光活化细胞分选仪(FACS)显示S-ECD反应性IgG+B细胞的百分率为0.56%~11%。为避免丢失细胞表面S-ECD特异性受体拷贝数低的B细胞，我们从另外5例恢复期患者(6-10例)的混合PBMC中分选血浆B细胞，而不使用S-ECD蛋白作为流式细胞术探针。血浆B细胞占CD3-CD19+Bc的百分比

为了筛选S蛋白特异性抗体，我们用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定了以上399株人单抗的结合特异性。从供体1-5中分别鉴定出1、16、1、3和9株S-ECD特异性mAb。总共从供体6-10中鉴定出35个S-ECD特异性mAb(图2A)。我们进一步表征了含有S蛋白不同片段的35株单抗的结构域特异性，包括S1、S2和RBD(图2A)。根据其EC50值将S反应性单抗分为4个主要组(图2A)。组1仅识别S-ECD。第2组识别S-ECD和S1，2A亚组结合S-ECD和S1，2B亚组结合S-ECD、S1和RBD。组3与S1和S2两者交互，其中子组3A以RBD为目标，而子组3B无法绑定RBD。组4识别S-ECD和S2。值得注意的是，在35个S特异的mAb中，只有4个mAb识别RBD(图2，A和B)。

用ELISA对几种有代表性的mAb进行竞争结合试验，以确定不同mAb之间是否有重叠的抗原位点，以CR3022作为阳性对照mAb，据报道与SARS-CoV-2RBD(图2C)结合(37)。在这些mAb中，2A组的4A8与2B组的1M-1D2竞争。2B组的另一株RBD反应性mAb 2M-10B11与CR3022竞争，提示这两株mAb在RBD上有重叠表位。这些结果表明，自然感染SARS-CoV-2引起的抗体应答在S蛋白的表位识别上是不同的。

根据VHDJH和VLJL的氨基酸序列，在MEGA7软件(38)中采用邻接法分析了这些S-ECD特异性mAb在基因使用和亲和力成熟方面的多样性。结果表明，来自10个供体的35株单克隆抗体中，VH基因的用途差异很大，其中VH3-30是使用频率最高的种系基因。在S1、S2或RBD反应性mAb中没有鉴定出特别受欢迎的VH基因(图2D)。在35株S-ECD特异性mAb中，重链可变区基因序列同源性在40.9%~97.6%之间。S2和表S2)。

我们首先在Vero-E6细胞中用正宗的SARS-CoV-2对35株S-ECD特异性mAb进行了体外中和研究(图3A)。在35株S-ECD特异性mAb中，只有3株mAb中和了正宗SARS-CoV-2。单抗1M-1D2、4A8和0304-3H3具有中、高中和能力，中效浓度(EC50)分别为2 8、0.6 1和0.0 4μg/ml。正如预期的那样，RBD靶向对照单抗CR3022未能中和正宗的SARS-CoV-2(37)。此外，虽然CR3022竞争单抗2M-10B11与SARS-CoV-2 RBD结合，EC50为5 ng/ml(图2A)，但它也不能中和正宗的SARS-CoV-2。这些结果表明，mAb与RBD的结合亲和力与mAb的中和能力并不完全相关。为了进一步研究3株正宗SARS-CoV-2中和单抗4A8、0304-3H3和1M-1D2的抑制活性，我们用实时荧光定量PCR检测了每株单抗处理的Vero-E6细胞中正宗SARS-CoV-2的RNA载量(图3B)。与细胞病变效应(CPE)试验结果(图3A)一致，mAb0304-3H3和4A8显示出比1M-1D2(图3B)更高的抑制能力。

接下来，我们用HIV载体的假型SARS-CoV-2(39)对所有35株S结合的mAb进行了荧光素酶报告基因分析，其中3株mAb显示出对假型病毒的中和活性(图3C)。4A8保护ACE2-293T细胞的EC50为49μg/ml，2M-10B11和9A1单抗虽不能中和正品SARS-CoV2，但2M-10B11对伪型病毒的保护作用较弱，EC50值为170μg/ml，9A1保护作用较弱。令我们惊讶的是，没有观察到0304-3H3和1M-1D2的中和作用(图3C)。抗MERS-CoV的单克隆抗体(40，41)也观察到假型SARS-CoV-2与正品SARS-CoV-2的结果不一致，这可能是由于病毒所经历的不同环境因素(如用于中和试验的细胞或用于产生假型或正品病毒粒子(42)的细胞)导致S蛋白呈现的不同所致。基于这些结果，4A8对真型和假型SARS-CoV-2均表现出较强的中和能力，是治疗SARS-CoV-2的潜在候选药物。

为了确定mAb的可能中和机制，我们用生物层干涉法测定了5株具有潜在中和活性的mAb与S蛋白不同片段的结合亲和力，包括完整的S-ECD结构域、S1、S2和RBD结构域。所有5株受试mAb都与S-ECD结合，高亲和力平衡解离常数(KD)小于2.14 nm(图4A)。4A8和1M-1D2与S1结合，KD分别为92.7 nM和108 nM，而0304-3

为了研究4A8与S蛋白之间的相互作用，我们在总分辨率为3.1ä的情况下求解了复合物的冷冻EM结构(图5和电影S1)。有关低温EM样品制备、数据采集和处理以及模型建立的详细信息，请参见补充资料(图8)中的“材料和方法”部分。S3至S5)。S蛋白表现出类似于先前报道的结构(21，22)的不对称构象，三个rbd中的一个处于“向上”构象，另外两个rbd处于“向下”构象(图5)。

在S蛋白-4A8复合物中，每个三聚体S蛋白与三个溶解的4A8 Fab结合，每个Fab与S蛋白的一个NTD相互作用。尽管三个S蛋白原型的构象不同，但4A8与每个NTD之间的界面是相同的(图5和图5。S3I)。NTD-4A8区域的地图质量通过集中细化到3.3º的本地分辨率而得到改善，从而能够可靠地分析NTD和4A8之间的相互作用。

与4A8的结合似乎稳定了NTD表位，该表位仅在已报道的S蛋白结构(21，22)中是看不见的。在NTD的高分辨率支持下，我们能够建立NTD的5个新环的结构模型，分别为N1(残基14-26)、N2(残基67-79)、N3(残基141-156)、N4(残基177-186)和N5(残基246-260)，其中N3和N5环介导与4A8的相互作用(图3)。S5A)。此外，在该结构中还鉴定了NTD上的三个新的糖基化位点(Asn17，Asn61，Asn149)。(中六)。

4A8的重链主要通过三个互补决定区(CDR)与NTD结合，即CDR1(残基25-32)、CDR2(残基51-58)和CDR3(残基100-116)(图6A和图6A)。S5B)。界面由广泛的亲水相互作用网络组成，4A8-NTD界面的埋表面积为832ä2。NTD N5环上的Arg246代表一个由Trp258稳定的对接位点，同时与CDR1上4A8的Tyr27和Glu31相互作用(图6B)。在NTD的N3环上，Lys150和Lys147分别与4A8的Glu54和Glu72形成盐桥(图6C)。Lys150也与4A8-Tyr111形成氢键(H键)，而His146与4A8-Thr30形成氢键(图6C)。除了亲水相互作用外，NTD N3环上的Trp152和Tyr145还通过疏水和/或π-π相互作用与4A8的CDR3上的Val102、Pro106和Phe109相互作用(图6d)。此外，Asn149在NTD上的糖基化位点靠近4A8-NTD界面，其中N-聚糖可能参与了界面上的相互作用(图6A和图6A)。(中六)。

鉴于持续的新冠肺炎大流行，迫切需要对SARS-CoV-2感染进行预防和治疗干预。我们的工作表明，从10名康复供者的B细胞中分离出的自然产生的人SARS-CoV-2mAb在S蛋白的基因用途和表位识别方面存在差异。值得注意的是，大多数分离的mAb不识别RBD，所有中和正宗SARS-CoV-2的mAb都不能抑制S蛋白与ACE2的结合。这些意想不到的结果表明，除了抑制病毒与受体的相互作用外，还存在其他重要的机制来中和SARS-CoV-2。

S1靶向mAb4A8不阻断ACE2和S蛋白之间的相互作用，但在体外对真型和假型SARS-CoV-2均表现出较高的中和性。许多针对SARS-CoV-2的中和抗体被报道针对S蛋白的RBD，并阻断RBD与ACE2(28-30，32-34)的结合。结果表明，4A8与S蛋白的NTD结合，具有较强的中和活性。前期研究表明，mAb7D10可能通过抑制RBD-DPP4的结合和抑制融合后S蛋白的构象变化(26)而与MERS-CoV S蛋白的NTD结合。我们将7D10的晶体结构与MERS-CoV的S蛋白的NTD进行比对，发现mAb与NTDs之间的界面部分重叠(图3)，7D10的晶体结构与MERS-CoV的S蛋白的NTD比对，发现mAb与NTDs之间的界面部分重叠(图3)。第7条)。7D10可能通过其靠近RBD的轻链抑制MERS-CoV与DPP4的相互作用。在我们的复合物中，4A8的轻链远离RBD(图3)。第7条)。因此，我们推测4A8可能通过抑制S蛋白的构象变化而中和SARS-CoV-2。此外，SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白序列比对显示不同的NTD表面序列，这些NTD表面序列分别被不同的mAb识别(图3)。(第8条)。

总之，这项工作报告了一种识别SARS-CoV-2S蛋白上NTD脆弱表位的全人中和mAb，其作用机制与受体结合抑制无关。组合

致谢：我们感谢西湖大学的低温电磁设备和超级计算机中心分别提供低温电磁和计算支持。我们感谢中国军事医学科学院北京微生物与流行病学研究所提供了SARS-CoV-2。我们也感谢廷芳，廷宇，彭绿，马恩浩提供的技术支持。资助项目：国家重点研发计划(2020YFC0841400)、国家自然科学基金(项目31971123、81803429、81703048、31900671、81920108015、31930059)、浙江省 重点R&D 计划(2020C04001)、浙江省科技厅SARS冠状病毒2型应急项目(2020C03129)、杭州市创新创业团队引进计划、国家科技创新创业团队引进计划(2020C04001)、杭州市科技创新创业团队引进计划(2020C03129)、浙江省科技攻关计划(2020C04001)、杭州市科技创新创业团队引进计划(2020C03129)、浙江省科技攻关计划(2020C04001)、浙江省科技厅SARS冠状病毒应急项目(2020C03129)。作者供稿：W.C.，Q.Z.和J.L.构思了这个项目。X.C.，R.Y.，J.Z.，G.Z.，Y.Z.，Y.G.，Y.L.，L.X.，M.H.，Z.Z.，P.F.，Y.D.，Z.C.，J.L.Z.，X.S.，Y.C.，L.F.，L.H.，J.X.和C.Y.做了实验。所有作者都对数据分析做出了贡献。X.C.，R.Y.，J.L.，Q.Z.和W.C.撰写了这份手稿。竞争利益：W.C.，J.L.，X.C.，J.Z.，L.F.，C.Y.，J.X.，L.H.，G.Z.，P.F.，M.H.，Y.D.，X.S.，Y.C.和J.Z.被列为发明人。

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