脑筋急转弯

跳转到导航跳转搜索脑弓是一个过程，通过这个过程，大脑中的单个神经元可以通过荧光蛋白与邻近的神经元区分开来。通过在单个神经元中随机表达不同比例的绿色荧光蛋白的红色、绿色和蓝色衍生物，可以用不同的颜色标记每个神经元。这一过程是对连接学领域的重大贡献，传统上被称为霍奇学，这是对大脑中神经连接的研究。

这项技术最初是在2007年由哈佛大学的杰夫·W·利希特曼(Jeff W.Lichtman)和约书亚·R·萨尼斯(Joshua R.Sanes)领导的一个团队开发的。[1]最初的技术最近已被用于其他模式生物，包括黑腹果蝇、秀丽线虫[需要引用]和拟南芥。[2]。

虽然早期的标记技术只允许映射几个神经元，但这种新方法允许100多个不同映射的神经元同时以这种方式进行差异照明。由此产生的图像可能相当令人震惊，并在科学摄影比赛(需要引用)中获奖。

脑弓神经成像技术最初是由哈佛大学的一组研究人员于2007年开发的。[1]当时他们在圣路易斯的华盛顿大学工作。这个特殊的科学家小组由杰夫·W·利希特曼(Jeff W.Lichtman)和约书亚·R·萨尼斯(Joshua R.Sanes)教授领导，他们都专门从事分子和细胞生物学，并以其工作而享有盛誉。研究小组使用两步法构建了Brainbow：首先，生成了一种特定的基因结构，该结构可以在多种排列中重组，根据正在实施的特定荧光蛋白(XFP)产生三种或四种颜色中的一种。[3]接下来，将同一转基因构建物的多个拷贝插入到目标物种的基因组中，导致不同XFP比率的随机表达，并随后导致不同的细胞呈现出不同的色彩。[3]。

Brainbow最初是作为对高尔基染色和染料注射等更传统的神经成像技术的改进而发明的，这两种技术都对研究人员显示大脑中复杂的神经电路结构的能力造成了严重的限制。[1]虽然旧的技术只能用有限的颜色对细胞进行染色，通常利用双色和三色转基因小鼠来揭示关于神经元结构的有限信息，但Brainbow要灵活得多，因为它能够用多达100种不同的色调对单个神经元进行荧光标记，这样科学家就可以识别甚至区分树突和轴突。[3]通过揭示神经元连通性和模式的详细信息，有时甚至是在活体中，科学家们经常能够推断出关于神经元相互作用及其随后对行为和功能的影响的信息。因此，“脑弓”填补了以前神经成像方法留下的空白。

随着最近在神经科学领域的出现，研究人员现在能够构建特定的神经回路图，并更好地研究这些回路与各种精神活动及其相关行为之间的关系(即，大脑弓揭示了影响整体大脑功能的神经元之间的相互联系及其随后的相互作用的信息)。因此，作为这种方法的进一步外推，“脑弓”还可以通过分析神经图谱的差异来研究神经和心理疾病。[3]。

脑弓技术依赖于Cre-Lox重组，在Cre-Lox重组中，蛋白Cre重组酶驱动loxP位点之间的DNA倒置或切除。最初的脑弓方法包括脑弓-1和脑弓-2，这两种方法利用了不同形式的cre/lox重组。脑弓-3是脑弓-1的改进版，于2013年开发。[4]对于所有脑弓子类型，给定XFP的表达式是随机的或随机的事件。

Brainbow-1使用具有不同荧光蛋白基因(XFP)的DNA结构，这些基因由loxP的突变形式和规范形式分隔。这创造了一组相互排斥的切除可能性，因为cre介导的重组只发生在相同的loxP位点之间。[1]重组发生后，唯一表达紧接在启动子后面的荧光蛋白。因此，一个由三个不同的loxP位点、三个切除事件分隔的四个XFP的构建体和原始构建体可以产生四个不同的荧光蛋白。[3]

Brainbow-2使用Cre切除和倒置来允许在给定结构中有多种表达可能性。在一个带有两个相反方向XFP的DNA片段中，Cre会诱导一个随机的反转事件，使一个荧光蛋白保持正确的方向表达。如果这些可逆序列中的两个被比对，则可能发生三种不同的反转事件。当切除事件也被考虑时，对于Cre切除和倒置的给定组合，将表达四种荧光蛋白中的一种。

Brainbow-3保留了Brainbow-1loxP格式，但用mOrange2、EGFP和mKate2替换了RFP、YFP和CFP基因。之所以选择MO2、EGFP和MK2，既是因为它们的荧光激发和发射光谱重叠最小，也是因为它们有最小的序列同源性，允许设计选择性抗体，可以用来在免疫组化方案中检测它们。Brainbow-3还通过使用XFP的法尼化衍生物解决了XFP不均匀填充神经元的问题，XFP被更均匀地输送到神经细胞膜上。[4]。

在体内，脑弓是通过杂交两个转基因有机体株来实现的：一个表达Cre蛋白，另一个已经转染了几个版本的loxP/XFP结构。使用转基因的多个拷贝允许XFP以一种方式结合，可以提供大约100种不同的颜色中的一种。[3]因此，每个神经元根据其给定的荧光蛋白的组合和随机表达被标记为不同的色调。

为了将XFP的差异表达模式阐明为可见的形式，用共聚焦显微镜对脑片进行成像。当暴露在具有其特定激发波长的光子中时，每个荧光团发出一个信号，该信号被收集到红、绿或蓝通道中，并用数据分析软件对所产生的光组合进行分析。[1]不同颜色神经元的叠加允许复杂神经回路的视觉解缠。

到目前为止，Brainbow主要是在小鼠身上进行测试；然而，自从2007年引入最初的方法以来，上述基本技术也进行了修改，以便在最近的研究中使用。

老鼠的大脑有7500万个神经元，比果蝇和其他常用的生物(如线虫)更类似于人脑。老鼠是第一批成功应用脑部成像方法的生物。[1]Liveet al.。(2007)利用上文所述的Brainbow-1和Brainbow-2开发了两种版本的Brainbow小鼠。[1]在使用这些方法创建完整的地图和跟踪鼠标肌肉的轴突时，需要收集数万张图像并将其汇编成堆栈，以创建完整的示意图。[3]然后就可以追踪到每个运动轴突和它的突触接触，以构建一个完整的肌肉连接体。

在转基因小鼠中使用脑弓技术检查的神经元更多的例子位于支配耳朵肌肉的运动神经、脑干中的轴突束和海马齿状回。[3]。

果蝇大脑的复杂性，由大约10万个神经元组成，使其成为实施神经生理学和神经科学技术(如Brainbow)的绝佳候选者。事实上，斯蒂芬妮·汉佩尔等人。(2011)将Brainbow与基因靶向工具相结合，以识别果蝇大脑中的单个神经元和各种神经元谱系。[5]遗传靶向工具之一是GAL4/UAS二元表达系统，其控制UAS-Brainbow的表达，并将其表达靶向小的神经元群。利用“Flip Out”方法提高了报告结构的细胞分辨率。荧光蛋白的表达，就像最初的Brainbow一样，依赖于与匹配的lox位点相对应的Cre重组。Hampel等人的研究成果。(2011)也开发了他们自己的脑弓变体(DBrainbow)，基于抗原表位的抗体标记，而不是内源性荧光。[5]它们构造的两个副本可产生六种明亮的、可分离的颜色。这一点，加上颜色分配的简化，使他们能够在很长的距离上观察每个神经元的轨迹。具体地说，他们追踪了从触角叶到神经肌肉接头的运动神经元，使他们能够识别单个神经元的特定肌肉目标。

最终，这项技术提供了有效绘制果蝇神经元电路图的能力，以便研究人员能够揭示这种无脊椎动物的大脑结构及其与随后行为的关系的更多信息。

与任何神经成像技术一样，Brainbow有许多限制，这些限制源于执行该技术所需的方法。例如，从胚胎干细胞培育至少两种转基因动物的过程既耗时又复杂。即使成功创造了两个转基因物种，也不是所有的后代都会出现重组。因此，这需要在执行实验之前进行广泛的计划。[3]。

此外，由于荧光蛋白表达的随机性，科学家无法精确控制神经回路的标记，这可能导致对特定神经元的识别能力较差。

脑弓在哺乳动物群体中的使用也受到中枢神经系统神经元令人难以置信的多样性的阻碍。神经元的绝对密度，加上长轴突的存在，使得用高分辨率观察中枢神经系统的更大区域变得困难。在复杂的多细胞环境背景下研究单细胞分辨率时，“脑弓”是最有用的。然而，由于光学显微镜分辨率的限制，对神经元之间突触联系的确凿识别并非易事。在观察突触连接时，通过使用突触标记来补充光学显微镜的使用，可以在一定程度上避免这个问题。[6]。

^a b c d e f g Livet，J.；Weissman，T.A.；Kang，H.；Draft，R.W.；Lu，J.；Bennis，R.A.；Sanes，J.R.；Lichtman，J.W.(2007)。神经系统中荧光蛋白组合表达的转基因策略。大自然。450(7166)：56-62。密码：2007Natur.450...56L。DOI：10.1038/nature06293.。PMID为17972876。

詹妮弗·马赫(2011-07-01)。与脑弓系统兄弟的克隆分析"；。植物细胞。23(7)：2471。Doi：10.1105/tpc.111.230710.。ISSN：1532-298X。太平洋投资管理公司上涨了3226220。

^a b c d e f g h i Lichtman，Jeff；Jean Livet；Joshua Sanes(2008年6月)。连接件的彩色处理方法。“自然”杂志回顾神经科学。9(6)：417-422。DOI：10.1038/nrn2391.。太平洋投资管理公司上涨了2577038。PMID为18446160。

^a b Cai，D.；Cohen，K.B.；Luo，T.；Lichtman，J.W.；Sanes，J.R.(2013)。"；改进的Brainbow工具箱工具"；。自然界的方法。10(6)：540-547。DOI：10.1038/nMeth.2450.。太平洋投资管理公司上涨了3713494。PMID为23817127。

^a b Stefan ie Hampel；Phuong Chung；Claire McKella；Donald Hall；Loren Looger；Julie Simpson(2011年2月)。果蝇脑弓：一种基于重组酶的荧光标记技术来细分神经表达模式。自然界的方法。8(3)：253-260。DOI：10.1038/nMeth.1566.。太平洋投资管理公司上涨了3077945。PMID为21297621。

^Dhawale，A；Bhala(2008)。网络与突触：卡哈尔100年后。HFSP期刊。2(1)：12-16.DOI：10.2976/1.2835214。太平洋投资管理公司上涨了2640997。PMID为19404449。