这篇文章的各个部分是由Cornelia Scheitz共同撰写的。最近更新于2021年1月18日。
伯特·休伯特（Bert Hubert）撰写的有关逆向工程的出色且广泛分享的文章是辉瑞-BioNTech SARS-CoV-2疫苗源代码的全部，目的是在一夜之间将数百名软件工程师和其他硅谷类型转变为扶手椅疫苗专家！撇开笑话，这篇文章解释了辉瑞-BioNTech COVID-19疫苗中4284个碱基对长的mRNA，适合那些对软件比对分子生物学更熟悉的人。
伯特的文章主要是关于疫苗的生物学特性，它与病毒的关系以及它在人体中的作用，但是关于疫苗生产的一句话是：
在疫苗生产过程的一开始，就有人将此代码上传到DNA打印机（是），然后将磁盘上的字节转换为实际的DNA分子。
在其旁边的是CodexDNA BioXP设备的图片，该设备被宣传为生产“最多7,000个碱基对的定制DNA片段”。这会是下一次分布式制造革命吗？这次是用在我们的车库中制作COVID-19疫苗的DNA打印机代替3D打印机和塑料小部件吗？
我将从坏消息开始：没人会很快在他们的车库里生产mRNA疫苗。
以下文字是我写下的笔记集，这些笔记是我在探索和生产两种新疫苗的过程中写下的，这些新疫苗在最近几周的新闻中以及越来越多的人的怀抱中出现了。我开始阅读有关mRNA的文章，但很快就发现自己对玻璃小瓶和温度跟踪设备的了解。
本文是在2021年1月上旬，为期一周的晚上撰写的，涵盖了目前已获准在我居住的美国分发的两种疫苗：一种由辉瑞BioNTech提供，另一种由Moderna提供。其他几种基于mRNA的COVID-19疫苗正处于临床试验的不同阶段，可能在某些方面与本文所述相似，而在其他方面有所不同。
我不太可能一切都正确。欢迎提出更正和建议，请发送电子邮件至[email protected]。
成分列表或工程术语中的“物料清单”是了解任何产品供应链的良好起点。辉瑞-BioNTech疫苗和Moderna疫苗的成分表是公开的，并且已被广泛报道。
辉瑞BioNTech疫苗的代号为“ BNT162b2”，注册商标为“ Corminaty”，国际非专有名称为“ Tozinameran”。成分列表可以在www.cvdvaccine.com上各个国家/地区特定产品网站或英国MHRA等政府网站上获得的信息材料中找到。还有一个Wikipedia页面。
Moderna疫苗也称为“ mRNA-1273”，但似乎缺少“ Moderna COVID-19疫苗”以外的品牌名称，这就是产品标签上所说的名称。成分列表可在Moderna网站上的EUA简介中找到，或在这些FDA会议记录中找到。它也有一个Wikipedia条目。
两种疫苗共享一些成分，但不是全部。下表是我尝试对可用信息进行排序并将两者进行比较的尝试。
除了疫苗瓶中的物质外，Pfizer-BioNTech还需要在使用前不久用氯化钠稀释（更多信息见下文）。 Moderna疫苗似乎不需要这种“ DIY组装”步骤。
免责声明：除非您具有适当的安全培训和设备，否则请不要进行化学或制造药物。我在下面提供了指向在线商店的链接，但请注意，这些商店“仅供研究使用”，在开展业务之前，将验证您与研究组织的隶属关系。
要制造RNA，首先要制造DNA。如果您知道分子生物学的中心教条，那么这是有道理的，就本文而言，它可以简化为“ DNA产生RNA，RNA产生蛋白质”。制作DNA的过程分为三个步骤，是众所周知的稳定过程：
创建：以某种方式合成少量所需DNA的副本。当我住在旧金山时，就在我公寓附近的街上有像Twist Bioscience这样的公司。
复制：通过电泳将该DNA插入无害的大肠埃希氏细菌中，也就是将它们涂膜。
将这些细菌放入充满营养的不锈钢生长室中，使其繁殖四天。
排干大桶，杀死细菌，然后提取DNA。根据生长室的体积，这可能需要一周或更长时间。
验证：执行几次测试以确认您获得的DNA是您想要的DNA。不需要我解释测试特定DNA序列的存在是如何工作的，大家已经知道，九个月前，当您阅读有关COVID-19测试如何工作的文章时，就已经知道了。
这产生了DNA克，所需的是mRNA袋。 mRNA是疫苗中讨论最多的成分，原因有以下三个：
这是第一次批准mRNA疫苗，现已大规模生产。
大规模生产mRNA的技能和相关的供应链是新的。 1众所周知，活细胞中从DNA到mRNA的转化过程。但是，大规模地，在工厂中并且具有长保质期仍然是一个发展领域。为了繁殖DNA，我们利用了大肠杆菌，这种微小的生物体具备了工作所需的所有组件。相同的过程不适用于制备疫苗的mRNA。取而代之的是，DNA与核苷酸，聚合酶和保护mRNA的特殊酶结合在一起。 2
第三部分，保护mRNA，是问题的症结所在。 mRNA不是很稳定，尤其是在末端。如果丢失句子的第一个和最后一个单词，其含义可能会完全丢失。在这里可能会发生同样的情况，疫苗将不再起作用。为了保护mRNA声明的开始，使用mRNA帽2'-O-甲基转移酶和牛痘加帽酶（VCE）添加了5'帽。 （名称中的“牛痘”与疫苗无关。）为了保护mRNA的末端，我们使用Poly（A）Polymerase在消息中添加了poly（A）尾部。新英格兰生物实验室的在线商店列出了mRNA Cap，VCE和Poly（A）Polymerase的价格。
疫苗中除mRNA以外的所有成分都是“赋形剂”，其目的与某种程度上将疫苗从工厂运送到人体细胞有关。
脂质是脂肪分子。两种疫苗均包含四种类型的脂质。胆固醇，磷脂酰胆碱，可电离的阳离子脂质和聚乙二醇化的磷脂。在疫苗中，这些脂质在称为脂质纳米颗粒（LNP）的RNA周围形成一个胶囊，可保护其免受有害环境的侵害，直至进入人体细胞。
辉瑞-BioNTech和Moderna均使用许多药物中已经批准的相同结构组分。
DSPC，全名Distearoylphosphatidylcholine或1,2-disearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，是保护双层mRNA的脂质双层的主要成分。
胆固醇对人体是天然的。在疫苗中，它用于获得最佳的脂质体形成和结构。
其他两种成分用于优化LNP的货物运输3，它们在药物配方中是新颖的或不常见的。
阳离子脂质或带正电荷的脂质可在组装过程中结合并帮助稳定带负电荷的mRNA。一旦进入细胞，细胞的不同pH环境就会触发mRNA的释放。 Moderna具有一种称为Lipid SM-102的专有分子。也许它不是专有的，因为它可能已由Arbutus Biopharma拥有的专利涵盖。 5 Moderna的“ 3期临床研究方案”将其定义为“十七烷-9-基8-（（2-羟乙基）（6-氧代-6-（十一烷基氧基）己基）氨基）辛酸酯”，并称之为“专有可电离脂质”。根据这条推文，2018年，Moderna的研究人员发表了一篇细胞论文，提出了10种新脂质，其中SM-102为8号。本文有一个“综合”部分和补充材料，有些人比我可能会复制的东西对这些事情有更多的了解。其他所有人都必须从例如Organix Inc以$ 5,000 / 100mg的价格购买它。
聚乙二醇化磷脂有助于稳定LNP，并保护其不受免疫系统的早期发现。它确保了LNP，因此mRNA可以达到其靶标。 Moderna使用DMG-PEG 2000或“ 1-单甲氧基聚乙二醇-2,3-二肉豆蔻基甘油”与平均分子量为2000的聚乙二醇。可以从Sigma Aldrich购买。
LNP的配方是疫苗和效率的关键。脂质的特定组合最有可能使Moderna纳米颗粒具有保护mRNA在更高温度下免于降解的能力（更多有关以下温度要求）。
控制疫苗的pH值很重要，因为值太高或太低都会破坏活性成分。术语“缓冲溶液”是指使溶液的pH值（几乎）保持恒定的物质。
PBS（磷酸盐缓冲盐水）是常用的缓冲液，由碱性磷酸钠二水合物，氯化钾，磷酸二氢钾和氯化钠制成。再次检查Pfizer-BioNTech的成分清单，您会发现所有这些都在那。
列为Moderna成分的氨丁三醇和盐酸氨丁三醇的组合被更普遍地称为“ tris缓冲液”，是另一种广泛使用的缓冲液。
PBS和tris在Google学术搜索上分别返回860k和400k结果。与其他成分相比，供应充足且成本可忽略不计。需要在实验室中使用tris缓冲液的科学家可以购买Tris Base（例如，从Sigma Aldrich购买）与水混合并用HCl 6调节pH。如果要大量使用，您可以与合同制造商合作。
乙酸钠与乙酸结合在一起（也包含在Moderna的疫苗中）是另一种已知的缓冲液，尽管Google的结果较少。
蔗糖是糖中的分子，糖是由甘蔗或甜菜制成的。其在疫苗中的目的是保护其他成分，使其在冷冻保存期间不受损坏。在这两种疫苗中，按重量计，它都是最大的非水成分，例如Moderna公司的非水成分为87 mg / mL。我想知道这是否意味着疫苗味道甜美。
最后，加水搅拌。只是开个玩笑，不要搅动：辉瑞-BioNTech的说明指定将小瓶上下颠倒快速旋转十次作为混合方案。不用担心，这样做不会破坏LNP。
接下来，让我们看看这些成分如何以工业规模整合到最终产品中。
辉瑞-BioNTech公司和Moderna公司在欧洲和美国都有两条很大程度上独立的供应链。为了最大程度地利用可用制造能力并通过冗余来增加弹性，这是有意义的。彭博社的《供应线通讯》指出，它也安抚某些“旨在通过对供应链行使主权来破坏国际合作的贸易保护主义政府”。
关于BioNTech和Pfizer之间关系的注释：BioNTech是几种COVID-19候选疫苗的最初开发者。 2020年3月，BioNTech宣布与辉瑞（Pfizer）合作，其中包括共同进行候选药物的临床试验，最终疫苗的开发以及所有其他向全球分销的剩余步骤，包括制造，分销，财务和营销。 7辉瑞公司对除三个国家以外的所有国家都拥有营销和经销权。 8这三个例外是：BioNTech自己进行市场销售和分销的德国和土耳其，以及上海复星医药公司拥有销售权的中国。 9
有趣的事实：BioNTech的总部街道地址是“ An der Goldgrube 12”，字面意思是“ At the Goldmine 12”。
辉瑞公司的美国供应链始于密苏里州圣路易斯，在其25万平方英尺的实验室和制造空间中，按照上述一般流程，克隆了DNA质粒的大肠杆菌菌正在努力工作。 《华盛顿邮报》上的这篇文章比以往更全面地描述了辉瑞的生产过程。
对于每一批，如果质量控制通过，则将产生的一克冷冻DNA运送到下一个工厂。据报道，这是辉瑞公司有时使用公司喷气式飞机或直升机的运输步骤（据WaPo称）。
Moderna将DNA生产外包给瑞士Lonza公司。 10 Lonza还执行了从DNA生成RNA的后续步骤，辉瑞在单独的设施中执行此操作（请参见下文）。
Lonza在2020年5月与Moderna签署协议至2021年1月之间建造了四条相同的新生产线。11其中一条生产线位于新罕布什尔州的朴次茅斯，并于7月开始生产。其中三台安装在瑞士Visp的Lonza总部附近一栋空旷的建筑物中，据报导，该设备将于2020年12月29日启动。Visp的既定目标是每天生产总计80万剂RNA。
自2018年以来，Moderna在马萨诸塞州的诺伍德经营着一座“两层，足球场大小的制造工厂”，据报道，Moderna此前所有临床试验的mRNA均已在此生产。 12
以辉瑞为例，来自圣路易斯的DNA被运送到位于美国马萨诸塞州安多佛的另一个辉瑞工厂，或运送至德国的BioNTech，以转化为mRNA。产生后，将mRNA纯化并冷冻在“大购物袋大小”的袋子中。 13这是最终确定的有效成分。我们成分清单中的第一项。
BioNTech生产的mRNA的纯化和最终浓缩由德国劳普海姆的Rentschler Biopharma完成。 14辉瑞和Lonza可能在公司内部（在安多弗，朴茨茅斯和维斯普）执行这两个步骤，或者也许我只是没有找到有关各自合作伙伴关系的公告。
从未按照COVID-19疫苗所需的量完成mRNA的生产。结果，从供应链的角度来看，它被认为是最危险的。在材料方面，限制mRNA所需的某些酶的可用性有限。 15在基础设施方面，直到几个月前，所需的专门设施和工人仅处理少量的研究工作量。 16
辉瑞从总部位于英国的Croda international采购所有四种脂质成分。该新闻稿暗示，位于阿拉巴马州阿拉巴斯特的最近收购的子公司Avanti Polar Lipids将负责生产。
Moderna从总部位于德国的CordenPharma公司采购所有脂质成分。 17位于科罗拉多州博尔德的一处设施进行了扩建，现在每批次可生产400公斤18。此外，还在瑞士利斯塔尔和法国尚诺夫建立了两处设施，以生产Moderna所需的脂质。根据此化学药品工程新闻文章CordonPharma必须将其产能扩大十倍，现在的产量是Moderna需求的三到四倍。
欢迎来到mRNA疫苗生产的瓶颈！世界上知道如何使脂质和mRNA结合成脂质纳米颗粒（LNP）的人数可能很少。而做这件事的机器可能根本不是机器，而是一次性的实验室工作台设置，例如《华尔街日报》这篇文章（付费专区）中的设置。
当前的问题是：如何以可复制的方式使四种脂质和mRNA结合在一起，从而形成LNP的保护区？您不仅可以将Vitamix中的所有部件组合在一起，然后运行思慕雪程序。可以，但是不会给您带来怪异的思慕雪，而不是mRNA填充的脂质纳米颗粒。本质上是精确控制分子大小，精确控制流速以及可能精确控制许多其他参数。微流体技术是满足这些要求的首选技术，最有可能用于mRNA疫苗生产中的纳米颗粒形成。
不列颠哥伦比亚省的温哥华似乎是全球LNP的专业知识中心之一。温哥华的Precision Nanosystems公司生产用于LNP生产的设备，并且是制造加拿大制造的COVID-19疫苗的一部分。 19同样位于温哥华的Transferra Nanosciences最近被德国化学巨型公司Evonik 20收购，但似乎并未参与任何COVID-19疫苗的开发。如果您想了解更多有关该过程的信息，那么值得关注的是Precision Nanosystems网站上的教育内容。同样位于温哥华的Acuitas Therapeutics公司也在开发LNP，并与包括辉瑞BioNTech在内的多家疫苗开发商合作。 21
奥地利维也纳以外的克洛斯特新堡是LNP的另一个全球卓越中心。这就是Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH公司的所在地，这是上述《华盛顿邮报》文章的主题。根据这篇文章，截至11月，正在进行技术转让以扩大Polymun在辉瑞和/或BioNTech内部的工艺。此外，辉瑞还使用了Acuitas Therapeutics开发的技术。 22另一篇先前引用的《华盛顿邮报》报道说，截至11月，卡拉马祖的LNP生产步骤已成为美国供应链的瓶颈。
总结：从发布的信息来看，供应链这一步骤的材料和技术转移的确切流程尚不清楚，并且可能仍在不断变化。
Moderna具有内部的LNP生产流程23，显然与媒体的接触不多，因为我无法发现任何信息。合同制造商Lonza最有可能为Moderna处理这一步骤。
2020年9月，BioNTech从诺华（Novartis）收购了整个运营工厂，该工厂打算执行从DNA生产到内部LNP生产的所有步骤。该工厂位于德国马尔堡，预计将于2021年上半年开始生产。24
包含mRNA和脂质的LNP的采购已在上面进行了介绍，其余成分是通用的且足够丰富，无法保证其自身的功能。
疫苗本身生产的其余步骤是将LNP，缓冲液和蔗糖混合在一起的“配方”，以及制药行业用于填充小瓶，贴标签和包装的术语“填充并完成”。
辉瑞公司在密歇根州卡拉马祖市执行这些最后步骤，该公司在该校拥有80栋大楼。在欧洲，辉瑞公司在比利时普尔斯的工厂首先执行相同的过程。混合后，将疫苗装入小瓶中，直到将其注射到某人的手臂中之前，它都会保留在其中。在卡拉马祖，有两条灌装线，其中一条达到每分钟600瓶。卡拉马祖（Kalamazoo）也是“冷冻场”的所在地，辉瑞存储了在获得EUA许可之前生产的疫苗，并允许其分发。
BioNTech还向位于莱比锡附近的布雷纳（Brehna）的Dermapharm的工厂发送了用于配制和填充和完成的疫苗，大概主要是为了满足德国的需求。 25还与瑞士Siegfried公司签订了另一份合同，在2021年中期在德国哈默尔恩开始生产。 26
Moderna没有辉瑞公司这样的国际巨头合作伙伴，因此将这些相同的步骤外包给美国的制造商Catalent 27和西班牙的LaboratoriosFarmacéuticosRovi来满足所有非美国需求28。
将五个0.3mL剂量的Pfizer-BioNTech疫苗合并到一个小瓶中。新闻媒体报道说，药瓶通常装满了，美国和欧盟的监管机构鼓励在可能的情况下从药瓶中补充剂量。 29 30 195小瓶放在托盘中并向上存放
......