撤离Crispr，润滑即将到来

（波士顿） - 虽然CRISPR-CAS9基因编辑系统已成为合成生物学创新的海报儿童，但它具有一些重大限制。 CRISPR-CAS9可以编程为发现和切割特定的DNA，但编辑DNA以产生所需的突变需要将细胞施加到使用新的DNA中以修复突破。这个诱饵和开关可以协调令人复杂，并且甚至可以对细胞有毒，因为Cas9也经常削减意外，偏离目标。

替代基因编辑技术称为重组机构通过在细胞复制其基因组的同时引入交替的DNA来进行该诱饵和开关，有效地产生遗传突变而不破坏DNA。这些方法简单，它们可以一次在许多细胞中使用，以便为研究人员创建复杂的突变池。然而，确定这些突变的效果需要将每个突变体分离，测序和表征：耗时和不切实际的任务。

哈佛大学和哈佛医学院（HMS）的Wyss生物学启发工程研究所研究人员已经创建了一种名为Retron Library Refombineering（RLR）的新的基因编辑工具，使得这项任务更容易。 RLR同时产生多达数百万个突变，并“条形码”突变细胞，使得可以一次筛选整个池，从而能够容易地产生和分析大量数据。已经在细菌细胞中完成的成就在PNA的最近纸中描述。

“rlr使我们能够做一些不可能用Crispr做的事情：我们随机切碎细菌基因组，原位将那些遗传片段转化为单链DNA，并用它们同时筛选数百万个序列，”联合第一作者Max Schubert，Ph.D.，Wyss核心教师乔治教堂，博士，博士学位，博士学位“RLR是一种更简单，更灵活的基因编辑工具，可用于高度复用实验，其消除了毒性经常用CrisprprpRp观察到的毒性，并提高了研究人员探索基因组水平突变的能力。”

润滑是细菌DNA的段，其经历逆转录以产生单链DNA（SSDNA）的片段。几十年来克隆的存在是已知的，但SSDNA的功能从20世纪80年代生成了浮动科学家，直到2020年6月，当一个团队终于想到了转速SSDNA检测病毒是否感染细胞，形成细菌免疫的一部​​分系统。

虽然克隆原本被视为一种神秘的细菌怪癖，但研究人员在过去几年中对他们更感兴趣，因为它们就像CRISPR一样，可以用于细菌，酵母，甚至人体细胞中的精确和灵活的基因编辑。

“长期以来，Carprprp只是被认为是细菌所做的奇怪的事情，并弄清楚如何利用它为基因组工程改变了世界。克隆是另一个细菌创新，也可能提供一些重要的进步，“舒伯特说。几年前，他对润滑的兴趣是在细菌中生产SSDNA的能力 - 一种有吸引力的特征，用于寡核苷酸重组的基因编辑过程。

基于重组的基因编辑技术需要将含有所需突变的SSDNA集成到生物体的DNA中，这可以通过两种方式之一进行。双链DNA可以物理切割（例如，用CRISPR-CAS9）诱导细胞在修复过程中将突变序列掺入其基因组中，或突变体DNA链和单链退火蛋白（SSAP）可以掺入其基因组中被引入复制的细胞中，使得SSAP将突变链掺入子细胞的DNA中。

“我们认为撤销应该让我们能够在我们想要编辑的细胞内生产SSDNA的能力，而不是试图将它们从外部施力到细胞中，而不会损坏本土DNA，这是非常引人注目的品质，”CO -First作者Daniel Goodman，Ph.D.，Wyss Institute的前毕业生研究员，现在是UCSF的Jane Cufin Childs博士博物馆。

润滑的另一个吸引力是它们的序列本身可以用作“条形码”，其鉴定细菌库中的哪个个体已经接收到每种反压力序列，从而迅速地实现精确创造的突变菌株的汇集筛选。

看他们是否实际上可以使用润滑来实现与润滑，舒伯特和他的同事首先创造了将含有抗生素抗性基因的细菌DNA的圆形质粒，以及SSAP基因，以使转速序列集成到细菌基因组。它们将这些倒退质粒插入大肠杆菌细菌中，以便在20代细胞复制后成功集成到其基因组中。最初，载压重组系统的含量低于0.1％的大肠杆菌掺入所需的突变。

为了提高这一令人失望的初步表现，该团队对细菌进行了几种遗传调整。首先，它们灭活了细胞的“天然不匹配修理机械，其校正DNA复制误差并且因此可以在它们能够被传递到下一代之前”固定“所需的突变。它们还灭活了两种细菌基因，即用于消除自由浮动的酶的外切核酸酶。这些变化显着增加了掺入压力序列的细菌比例，超过90％的人群。

现在，他们相信他们的反rron ssdna被纳入细菌的基因组，该团队测试了它们是否可以使用逆量作为遗传测序“捷径”，使许多实验能够在混合物中进行。因为每种质粒都有自己独特的转速序列，可以用作“名称标签”，因为它们推出了它们应该能够序列更短的压力而不是整个细菌基因组来确定细胞已收到的哪种突变。

首先，该团队测试了RLR是否可以检测到大肠杆菌中的已知抗生素抗突变。他们发现它可以 - 与其他突变相比，含有这些突变的序列的序列在其测序数据中存在更大的比例。该团队还确定RLR敏感，足够精确地测量抗性抗性的小差异。至关重要的是，通过从整个细菌池中测序条形码而不是分离和测序单独突变体来收集这些数据，从而大大加速该过程。

然后，研究人员将RLR迈出了一步，看看它是否可以在随机碎片化的DNA上使用，并找出它们可以一次使用多少卷曲。它们切断了对另一种抗生素具有高度抗性的大肠杆菌的基因组，并使用这些片段来构建质粒压重序列中包含的数百万遗传序列的文库。 “RLR的简单性真的在这个实验中闪耀着，因为它使我们能够建立比我们目前与CRISPR一起使用的更大的库，其中我们必须合成指南和供体DNA序列以诱导每个突变，” Schubert说。

然后将该库引入RLR优化的E Coli菌株进行分析。再次，研究人员发现，当细菌池测序时，可以容易地识别赋予抗生素抗性的逆回物，以至于它们被测序池。

很长一段时间，Crisprp只是被认为是细菌所做的奇怪的事情，并弄清楚如何利用它为基因组工程改变世界。润滑是另一种可能提供一些重要进展的细菌创新。

“能够分析汇集，具有RLR的条形码突变体文库使同时进行数百万实验，允许我们观察到整个基因组中的突变的影响，以及这些突变如何相互互动，”高级作家乔治教会，领导Wyss Institute的合成生物学重点领域，也是HMS遗传学教授。 “这项工作有助于建立一种路线图，朝着在其他遗传系统中使用RLR，这为未来的遗传研究开辟了许多令人兴奋的可能性。”

将RLR与CRISPR区分开的另一个特征是，随着细菌的复制而成功地将所需突变结合到它们的基因组中的细菌的比例随着时间的推移而增加，而CRISPR的“一枪”方法倾向于在第一次尝试时成功或失败。 RLR可能会与CRISPR结合以改善其编辑性能，或者可以用作诸多系统中的替代品的替代品。

在RLR上仍有更多的工作来提高和标准化编辑率，但兴奋正在增加这个新工具。 RLR的简单，精简的大自然可以研究多个突变如何相互交互，以及产生可以使用机器学习的大量数据点来预测进一步的突变效应的数据点。

“这种新的合成生物学工具将基因组工程带来了更高水平的吞吐量，这无疑将导致新的，令人兴奋和意外的创新，”Wyss Institute的创始事事唐·伊格伯，唐·伊格博尔斯唐·索伯说。 Ingber也是HMS和波士顿儿童医院血管生物学教授的犹大民俗学教授，以及哈佛约翰A.保尔森工程学院的生物工程教授。

本文附加作者包括来自HMS的Himothy Wannier，来自Marwick大学的Sofjot Kaur，来自Massachusetts理工学院的Mashim Farzadfard和Timothy Lu，以及来自Gladstone数据科学和生物技术研究所的Seth Shipman。 该研究得到了美国能源部（DE-FG02-02ER63445）和国防科学与工程研究生奖学金的支持。