来自骆驼科动物和美洲驼的纳米抗体中和了 SARS-CoV-2 变种

自 COVID-19 大流行开始以来，SARS-CoV-2 已在全球造成数百万人死亡。尽管已经部署了许多疫苗，但病毒受体结合域 (RBD) 的不断进化对其功效提出了挑战。特别是，新出现的变异 B.1.1.7、B.1.351 和 P.1（分别在英国、南非和巴西首次检测到）损害了从 COVID-19 和免疫疗法中康复的患者血清的功效已获得紧急使用授权 1, 2, 3. 避免病毒逃逸的一种潜在替代方法是使用骆驼科动物 VHH（重链抗体的可变重链域（也称为纳米抗体）），它可以识别通常无法访问的表位常规抗体 4. 在这里，我们从美洲驼和小鼠中分离出抗 RBD 纳米抗体，我们设计这些小鼠以生产从羊驼、单峰驼和双峰驼中克隆的 VHH。我们确定了两组高度中和的纳米抗体。第 1 组通过识别冠状病毒中高度保守但很少被人类抗体靶向的 RBD 区域来规避抗原漂移。第 2 组几乎完全专注于 RBD-ACE2 界面，并且不会中和携带 E484K 或 N501Y 替换的 SARS-CoV-2 变体。然而，第 2 组中的纳米抗体在表达为同三聚体时保留了对这些变体的完全中和活性，并且据我们所知，可以与迄今为止生产的最有效的 SARS-CoV-2 抗体相媲美。这些发现表明，多价纳米抗体通过两种不同的机制克服了 SARS-CoV-2 突变：增强了对 ACE2 结合域的亲和力和对人类抗体在很大程度上无法获得的保守表位的识别。因此，尽管新的 SARS-CoV-2 突变体将继续出现，但纳米抗体代表了在疫苗受到损害时预防 COVID-19 死亡的有前途的工具。与小鼠和人抗体结合域（大小约为 50 kDa）相反，骆驼科动物 VHH 在约 15 kDa 时保留了完整的抗原特异性。这一特征以及扩展的互补决定区 (CDR) 使纳米抗体能够结合常规抗体 4 通常无法访问的表位，例如通常被聚糖屏蔽掩蔽的保守病毒域。纳米抗体可以很容易地人源化 5，在最近的临床试验中，它们似乎安全且免疫原性低 6。尽管有这些优点，但纳米抗体并未得到广泛应用。原因之一是骆驼是不适合学术设施的大型动物。也很少有试剂可用于从免疫的骆驼科动物中分离抗原特异性记忆 B 细胞 7。为了绕过这些障碍，我们试图通过将 18 个羊驼、7 个单峰驼和 5 个双峰驼 VHH 基因组合到 25-kb 插入中来在小鼠中产生纳米抗体盒式磁带（图 1a）。每个基因都与 VH 启动子、前导外显子和重组信号序列融合，以确保生理表达和重组（扩展数据图 1）。使用 CRISPR-Cas9，我们插入了 VHH 盒来代替小鼠胚胎干细胞中的 VH 基因座（图 1a）。 a，从羊驼、单峰驼和双峰驼中选出的 30 个 VHH 通过 CRISPR-Cas9 代替 2.5-Mb 小鼠 VH 基因座插入。来自 Cμ 和 Cγ1 的 CH1 外显子也被删除以避免抗体重链的错误折叠。 b，来自野生型 (WT) 小鼠或杂合纳米小鼠的脾脏 B220 + B 细胞的流式细胞术分析。 IgM +Igκ + 细胞表达常规的重轻链抗体，而 IgM +Igκ - 细胞在野生型小鼠（未显示）中主要是 Igλ + 或在纳米小鼠中是单链抗体 B 细胞。 c，来自未免疫和免疫纳米小鼠以及用 CD95 和 IgG1 染色的对照的脾细胞的流式细胞术分析。 d，饼图显示未免疫和免疫纳米小鼠中的 VHH 体细胞超突变。饼图段与带有图表外围指示的突变的 VHH 序列成比例。中间的圆圈显示了序列的总数，下面给出了突变频率。骆驼纳米抗体仅与专用 IgG2 和 IgG3 结合表达，后者在转录过程中剪接 CH1 外显子 4。在常规抗体中，CH1 的疏水表面有助于配对重链和轻链恒定域。为了在小鼠基因组中重现这种配置，我们从胚胎干细胞中的 Ighm 和 Ighg1 中删除了 CH1（图 1a）。靶向等位基因通过种系从小鼠嵌合体传递给 F 1 后代（以下称为“纳米组”）。正如预期的那样，野生型小鼠中大约 85% 的脾 B220 + B 细胞是 IgM +Igκ +（图 1b，左）。相比之下，杂合纳米小鼠中 72% 的脾 B220 + B 细胞显示 IgM +Igκ - 表型（图 1b，右），其中不到 2% 是 IgM +Igλ +（扩展数据图 2a），这意味着大部分纳米小鼠 B 细胞发育表达单链抗体。我们通过使用基因特异性引物放大 VHH-DJ 连接事件证实了这一观察结果。我们发现所有 30 个 VHH 都与骨髓和脾脏样本中的下游 JH 重组（扩展数据图 2b）。我们进行了深度测序分析，证实所有 VHH 基因都经历了 V(D)J 重组，因此有可能在免疫反应期间进行扩增（扩展数据图 2c）。在 VHH 纯合纳米小鼠中，B 细胞区室基本正常并显示所有发育阶段，包括 B1、B2 和边缘区 B 细胞（扩展数据图 3a）。一个区别是骨髓和脾脏中 IgM + 过渡和未成熟 B 细胞的数量分别增加，表明随着细胞从短寿命 CD23 高 CD21 低隔室过渡到长寿命 CD23 高CD21 低隔室，选择增强，在纳米小鼠中减少了 1.7 - 相对于野生型小鼠的倍数（扩展数据图 3a）。另一个显着特征是不存在 IgD（扩展数据图 3b）。这种表型可能是由于 Ighm 处 CH1 缺失导致的差异 mRNA 剪接造成的，因为 IgD 在仅缺失 Ighm CH1 纯合子的小鼠中也不存在（其中 VH 和 Ighg1 CH1 是完整的）（扩展数据图 3b）。总之，这些数据表明小鼠 B 细胞可以成熟表达单链抗体。为了探测活化，在脂多糖和白细胞介素 4 存在下分离和培养脾 B 细胞。在这些条件下，表达 VHH 的细胞经历增殖并将重组转换为 IgG1（扩展数据图 3b、c）。为了检查体内激活，我们用锁孔血蓝蛋白进行了腹膜内免疫。免疫后 ​​12 天，纳米小鼠的 B220 + CD95 highIgG1 + 生发中心 B 细胞的数量与对照组相当（图 1c）。

为了研究针对特定抗原的亲和力成熟，我们用人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1) 包膜三聚体 (BG505 DS-SOSIP) 8 免疫纳米小鼠（扩展数据图 3d）。 VHH 基因的超突变相对于未免疫对照增加（1.1 × 10 -2 对 7.5 × 10 -4）（图 1d）。突变谱显示 G-to-A 和 C-to-T 转换的富集（扩展数据图 3e），与活化诱导的胞苷脱氨酶催化一致 9. 为了测量针对 BG505 DS-SOSIP 的抗体反应，我们表征了为 HIV-1 三聚体识别而富集的 16 个纳米抗体。序列分析显示该组中 CDR3 在 JH 使用、突变和大小（9-16 个氨基酸）方面高度多样化（扩展数据图 4a）。为了测量结合动力学，我们应用了生物层干涉法。分析确定了四种 VHH9 变体，它们显示的解离常数 (K Ds) 范围为 2 到 13 nM——表明它们代表高亲和力结合剂（扩展数据图 4b，补充表 1）。我们得出结论，表达单链抗体的小鼠 B 细胞可以在免疫后经历亲和力成熟并产生高度特异性的纳米抗体。接下来，我们试图生产针对 SARS-CoV-2 的中和纳米抗体。为此，我们用 RBD 和稳定的 SARS-CoV-2 融合前尖峰免疫了三只纳米小鼠和一只美洲驼（图 2a）。我们在免疫后分离外周血单个核细胞，并将 VHH 扩增并克隆到噬菌粒载体中。在噬菌体展示之后，我们使用基于酶联免疫吸附测定的结合筛选富集了 RBD 特异性纳米抗体。我们的深度测序分析平均确定了每个文库 26,000 个纳米抗体变体，分别代表美洲驼和纳米小鼠的 192 个和 199 个独特的 CDR3（扩展数据图 5a）。然后，我们通过 CDR3（方法）对纳米抗体进行聚类，从每个亚组中分离出代表性克隆，并测试它们在体外阻断 RBD 与 ACE2 受体的结合 10。我们使用这种方法选择了六只美洲驼和六只纳米小鼠纳米抗体。 a，对美洲驼和纳米小鼠进行免疫以获得针对 SARS-CoV-2 RBD 的高亲和力纳米抗体。 b，结合固定化 RBD 的 Nb17 单体（左）和三聚体（右）的不同浓度的生物层干涉测量 (BLI) 分析。红色轨迹代表原始数据；动力学拟合在下方以灰色显示。提供了平衡 (KD) 常数。 c，总结所选纳米抗体的假病毒中和效力（IC 50）的表。值以摩尔浓度（左）或 ng ml -1（右）提供。 d，图中显示了作为单体、二价或三聚体（最后两个通过人或美洲驼 IgG2a 铰链结构域与人 IgG1 Fc 融合）在中和试验中使用的纳米抗体。 e，c中显示的20个纳米抗体对SARS-CoV-2假病毒的中和作用。突出显示了 Nb12 单体（红色）、二价（青色）和三聚体（洋红色）以及 Nb19 三聚体（蓝色）。数据代表两个独立实验，误差线是一式三份的平均值±标准差。为了完善候选名单，我们通过生物层干涉测量法测量了 RBD 结合亲和力。该分析鉴定了来自美洲驼的 4 个纳米抗体（设计的纳米抗体 (Nb) 15、Nb17、Nb19 和 Nb56）和来自纳米小鼠的 2 个纳米抗体（Nb12 和 Nb30），其解离常数低于 30 nM（图 2b，扩展数据图 5b-d，补充表 1)。解离速率从7.1 × 10 -3 s -1 变化到1.1 × 10 -3 s -1 ，表明所有纳米抗体的解离缓慢（扩展数据图5e）。我们接下来使用 SARS-CoV-2 尖峰 11 假型的慢病毒颗粒在体外探索了中和作用。纳米抗体单体显示出纳摩尔和亚纳摩尔半最大抑制浓度 (IC 50) 值，范围为 11.7 nM (168.5 ng ml -1 ) Nb12 至 Nb19 的 0.335 nM (4.6 ng ml -1)（图 2c）。与传统抗体相比，纳米抗体的一个重要优势是它们可以轻松组装成多聚体，这通常会产生显着的亲和力 12、13。为了探索这一特性，我们使用灵活的 GGGGS(×3) 接头将纳米抗体融合为三聚体，并将它们连接到人 IgG1 Fc 通过人铰链结构域或其更长、灵活的美洲驼对应物（图 2d）。我们还通过将两个 VHH 与 IgG1 Fc 融合来创建二价抗体（图 2d）。我们发现中和随着连接单体数量的增加而增加，从 Nb15 的 3 倍到 Nb12 的 180 倍（图 2c、e）。值得注意的是，四种最有效的多聚体纳米抗体（Nb12、Nb17、Nb19 和 Nb56）达到了皮摩尔范围内的 IC 50 值（从 65 到 9 pM）（图 2c、e）。据我们所知，这些值是迄今为止关于抗 SARS-CoV-2 纳米抗体的最佳报道之一 14。随着 SARS-CoV-2 在全球范围内的传播，出现了几种携带 RBD 突变的变体，这些变体增加了传播能力或允许逃避抗体中和。特别令人感兴趣的是 B.1.1.7 变体（其中包含 N501Y 替代），该变体导致英国 COVID-19 病例激增 15。第二个令人担忧的变体是 B.1.351，它将 N501Y 与两个额外的 RBD 替代相结合（K417N 和 E484K）。 P.1，在巴西迅速传播的第三个变体，显示出与 B.1.1.7 和 B.1.351 相似的变化：N501Y、K417T 和 E484K 16。所有这些突变都已显示降低血清抗体的功效由 Moderna 和 Pfizer–BioNTech 疫苗 1、2 引起。

我们首先探索了我们领先的纳米抗体是否可以中和带有 RBD 突变的 SARS-CoV-2 尖峰假型病毒。 R683G 替代增加了体外感染性 17 作为对照。与它们对野生型病毒的功效相反，Nb17、Nb19 和 Nb56 无法中和携带 E484K 取代的病毒，单独或与 K417N 和 N501Y 组合（图 3a）。同样，Nb15 对 N501Y 无效。然而，除 Nb17 外，纳米体都保持高效的二价或三价形式的粘合剂和中和剂（图 3a，扩展数据图 5e、6a）。在 Nb15 和 Nb56 三聚体的情况下，IC 50 值分别达到 30 pM 和 14 pM。因此，E484K 和 N501Y 取代使病毒能够从单体而非多聚体纳米抗体中逃逸。 a，携带野生型或突变型 SARS-CoV-2 尖峰的假病毒的中和试验（IC 50 值）。颜色渐变表示范围从 0（蓝色）到 50,000 pM（红色）的值。含有 E484K 或 K417N、E484K 和 N501Y (KEN) 的假型病毒也含有 R683G 替代。 b，中和试验显示 SARS-CoV-2 B.1.351 对不同浓度的三价 Nb15、Nb56 和 Nb12 以及二价 Nb30 的敏感性。数据代表两个独立实验，误差线是一式三份的平均值±标准差。 c，总结 BLI 竞争测定的示意图，其中连接到生物传感器的纳米抗体-RBD 免疫复合物与不同的纳米抗体一起温育以测量结合。 d-g，纳米抗体与 Nb12-RBD（d）、Nb30-RBD（e）、Nb15-RBD（f）和 Nb56-RBD（g）免疫复合物的结合。与美洲驼纳米抗体相比，纳米小鼠 Nb12 和 Nb30 的中和效力在很大程度上不受 RBD 突变的影响（图 3a），这表明它们识别的区域与受体结合基序不同。为了探索多聚纳米抗体是否对真正的病毒起作用，我们使用 SARS-CoV-2 WA1 和 B1.1.7、B1.351 和 P.1 变体，用三价 Nb15、Nb56 和 Nb12 以及二价 Nb30 重复中和试验。结果紧密地概括了假病毒的发现，显示了所有四个纳米抗体对野生型和三个变体的中和（图 3b，扩展数据图 6b）。值得注意的是，这些纳米抗体对 B1.1.7 变体最有效，IC 50 值介于 4 pM（对于 Nb15）和 538 pM（对于 Nb30）之间，并且对 B.1.351 变体的效果相对较差，显示出18 pM（对于 Nb56）到 2,755 pM（对于 Nb30）的范围（扩展数据图 6c）。 P.1 变体的中和作用是中等的（扩展数据图 6b、c）。美洲驼和纳米小鼠纳米抗体受变体不同影响的事实表明它们识别不同的 RBD 表位。为了测试这个想法，我们使用预先形成的纳米抗体-RBD 免疫复合物应用生物层干涉测量法，该复合物与第二个纳米抗体一起孵育（图 3c）。我们发现所有四种美洲驼纳米抗体，但不是 Nb30，都可以结合 Nb12-RBD 免疫复合物（图 3d）。类似地，Nb30-RBD 干扰了 Nb12 的结合，而美洲驼纳米抗体可以自由地与其结合（图 3e）。同时，Nb12 和 Nb30 识别美洲驼纳米抗体-RBD 复合物的所有组合，而美洲驼纳米抗体则不能（图 3f，g，扩展数据图 6d）。因此，纳米小鼠和美洲驼纳米抗体识别两个不同的中和 RBD 区域。与单链抗体的情况一样，美洲驼和纳米小鼠纳米抗体在很大程度上都是热稳定的，可以用市售的网状雾化器雾化而不会失去中和活性（扩展数据图 6e-g）。为了定义纳米小鼠纳米抗体结合的区域，我们在 Titian Krios 上收集了 Nb12 和 Nb30 与 HexaPro 10 复合物的单粒子冷冻电子显微镜数据，HexaPro 10 是 SARS-CoV-2 尖峰的预融合构建体（扩展数据图 7 , 8, 补充表 2)。在这两种情况下，我们都使用粒子减法、分类和局部细化来提高纳米体-尖峰界面的分辨率。 Nb12-spike 复合物的结构显示 Nb12 诱导了两个 RBD 向上、一个 RBD 向下的尖峰构象，Nb12 识别出一个区域朝向 RBD 中间、ACE2 结合区域之外和远离在新出现的关注变体中受影响的残基（417、484 和 501）（图 4a，扩展数据图 9a）。 Nb30-spike 复合物的结构显示 Nb30 诱导三 RBD 向上构象，Nb30 从 ACE2 结合基序和受逃逸突变影响的残基识别 RBD 另一端的区域（图 4b，扩展数据）图 9b)。

a，Nb12 与 SARS-CoV-2 尖峰复合物的冷冻电子显微镜结构。 b，如 a，对于 Nb30。 c，纳米抗体和尖峰之间的界面。 d，RBD 的表面特性，包括序列多样性（深紫色表示 sarbecovirus 之间的多样性），以及人类抗体识别 RBD 区域的流行率（黑树莓表示高流行率）和 ACE2 的结合位点（青色）。为了了解尽管识别出 ACE2 结合域外的表面，但两个纳米小鼠纳米抗体如何中和，我们将 ACE2-RBD 复合物 18、19、20 的结构与 Nb12 和 Nb30 的结构叠加（扩展数据图 9c）。我们观察到很大一部分 Nb12 域与 ACE2 发生冲突，这表明 Nb12 和 ACE2 结合在空间上不兼容。对于 Nb30，我们观察到与 ACE2 上的聚糖 N322 发生更微妙的冲突，但这也表明 Nb30 和 ACE2 的结合在空间上不相容。为了获得对纳米小鼠和美洲驼纳米体识别的中和区域的结构理解，我们还确定了与 HexaPro 复合的每个纳米体的 3D 负染色电子显微镜重建。这些重建表明，美洲驼纳米抗体统一靶向 ACE2 结合界面，Nb17、Nb19 和 Nb56 诱导单 RBD 向上构象，而 Nb15 与全 RBD 向下尖峰相关（扩展数据图 9d-h）。相比之下，纳米小鼠 Nb12 和 Nb30 都能识别 ACE2 结合位点外表面的 RBD（图 4c）。为了深入了解纳米小鼠与人类抗体识别的 RBD 区域的普遍性，我们在蛋白质数据库中叠加了 51 个 RBD 导向的人类中和抗体，并量化了残留水平的识别率（图 4d，补充表 3）。尽管识别扩展到大部分 RBD，但在受新出现突变影响的残基所在的 ACE2 结合区域中，人类抗体识别的流行率要高得多。相比之下，Nb12 和 Nb30 识别的区域在 sarbecovirus 中是保守的，并且显示出人类抗体识别的普遍较低。 Nb12 的表位与先前对 SARS-CoV 21 和 SARS-CoV-2 13、22 特异的纳米抗体识别的表位有很大的重叠，这增加了这些纳米抗体也可能阻断新的 SARS-CoV-2 变体的可能性。然而，Nb30 结合足迹离 ACE2 RBD 基序更远，覆盖的表面积在 sarbecovirus 中保守率为 79%，包括 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和蝙蝠冠状病毒（相比之下，Nb12 为 54%，在平均，人抗体为 23%）（图 4c，d，补充表 3）。与这些发现一致，我们发现 Nb12 和 Nb30 与 SARS-CoV 和蝙蝠冠状病毒 WIV16 的 RBD 结合并中和带有尖峰的基于 HIV-1 的假病毒，而 Nb56 则不（......