不完善的疫苗接种会增强高毒力病原体的传播（2015 年）

某些疫苗能否推动更具毒性的病原体的进化？传统观点认为，如果宿主死亡大大减少传播，自然选择将消除高度致命的病原体。因此，保持宿主存活但仍允许传播的疫苗可能会允许强毒株在人群中传播。在这里，我们通过实验表明，针对马立克氏病病毒对鸡进行免疫可增强毒性更强的菌株的适应性，从而使高致病性菌株的传播成为可能。直接接种疫苗或母体接种疫苗引起的免疫延长了宿主的存活，但不能防止感染、病毒复制或传播，从而延长了毒株的感染期，否则太致命而无法持续存在。我们的数据表明，不能阻止传播的抗疾病疫苗可以创造条件，促进病原体菌株的出现，从而在未接种疫苗的宿主中引起更严重的疾病。传染性病原体可以响应健康干预而迅速演变 [1]。在这里，我们询问病原体对接种疫苗的宿主的适应是否会导致更具毒性的病原体的进化（此处定义是指那些在未接种疫苗的宿主中导致更多或更快死亡的病原体）。疫苗接种可以通过以下方式促进更具毒性的病原体的进化。通常认为，阻止更具毒性的菌株进化出现的主要力量是它们杀死宿主，因此缩短了它们自己的感染期。如果是这样，用减少疾病但不能防止感染、复制和传播的疫苗（所谓的“不完美”疫苗）让宿主存活，可能会允许更多毒株传播。如果毒株在没有宿主死亡的情况下具有更高的传播能力或者能够更好地克服宿主免疫，自然选择甚至会促进它们的循环。因此，挽救生命的疫苗有可能增加病原体种群的平均疾病毒力（如在未接种疫苗的宿主中所测定的）[2-4]。这一想法（以下称为“不完美疫苗假说”）的合理性已被数学模型证实 [2, 5-9]。功效和作用方式是关键。如果疫苗正在消毒，从而阻止传播，则不会发生进化。但是，如果它是非灭菌的，因此自然获得的病原体可以从免疫个体传播（我们在下文中称为“泄漏”疫苗），那么在自然选择曾经将它们移除的情况下，毒性菌株将能够传播[2] ]。因此，抗病疫苗（那些减少宿主内复制或致病性的疫苗）有可能产生对人类和动物健康有害的进化；感染或传播阻断疫苗没有 [2-9]。请注意，疫苗驱动的毒力进化的可能性在概念上不同于疫苗驱动的表位进化（抗原逃逸），其中靶抗原的变体进化，因为它们使原本不太适合逃避疫苗诱导免疫的病原体成为可能。经常观察到逃逸变体的演变 [4, 10]。不完全疫苗假说引起了争议 [11-14]，尤其是因为人类疫苗显然没有导致其目标病原体的毒力增加。但大多数人用疫苗都具有杀菌作用（阻断传播）或未广泛使用或最近才推出 [4]。此外，明确比较菌株毒力和疫苗接种对传播的影响需要在自然宿主中进行实验性感染——这对于人类疾病显然是不可能的。兽医感染的情况有所不同。在这里，我们报告了马立克氏病病毒 (MDV) 的实验，这是一种高度传染性的致癌疱疹病毒，每年给全球家禽业造成超过 20 亿美元的损失 [15]。我们测试了不完全疫苗假说的一个关键预测：疫苗接种将使高毒株的适应性高于低毒株的适应性。鸡通过吸入被感染鸟类羽毛囊中脱落的病毒污染的灰尘而感染 MDV。在受污染的禽舍中，小鸡在孵化后很快就会被感染，并且终生保持传染性 [16]。该病毒可以在家禽粉尘中保持传染性数月 [17, 18]。正如最初描述的那样，马立克氏病 (MD) 是老年鸡的瘫痪，但到 1950 年代，出现了以年轻鸡多器官淋巴瘤为特征的“急性 MD”。这成为 MD 的主要形式，其毒力增加，其特征是更严重的淋巴瘤和越来越早的死亡率，在某些情况下，在生命的最初几周，也就是在淋巴瘤形成之前就出现瘫痪和死亡 [15, 19]。自 1970 年引入第一批疫苗以来，MDV 一直在用渗漏抗病疫苗免疫的家禽中进化 [15, 19-24]。所有 MD 疫苗都是对 18 天大的胚胎或孵化后立即接种的活病毒，接种过的禽类可能会被感染并排出野生型病毒 [25-28]。野生型 MD 病毒是所谓的血清型 1 病毒。第一代疫苗包括一种称为 HVT 的火鸡血清型 3 疱疹病毒；第二代疫苗是 HVT 和 SB-1（一种血清型 2 分离株）的组合。第三代疫苗基于减毒血清 1 型病毒分离株 CVI998，即所谓的 Rispens 疫苗 [15, 19–24]。

我们的前三个实验涉及罗德岛红 (RIR) 鸡，该品种尚未经过集约型选择育种和异种杂交的现代商业鸡品系特征。无特定病原体 (SPF) 的亲代鸟类未接种疫苗，因此我们前两个实验中使用的后代没有母源抗体。在我们的第一个实验中，我们用 5 种 MDV 菌株感染了 8 天大的小鸡，这些菌株被选为跨越 Witter 及其同事定义的毒力谱 [21, 29]。病毒株从毒力较低的 HPRS-B14（在 2 个月内杀死 60% 的未接种疫苗的鸟类）到高度致命的 Md5 和 675A（在 10 天内杀死所有未接种疫苗的鸟类）不等（图 1，上图）。当年龄匹配的鸟类提前 8 天接种 HVT（第一种投入商业使用的 MDV 疫苗）时，存活率显着提高，少数死亡仅在实验后期发生，然后仅在感染了最强毒株的鸟类中发生。图 1，顶板）。我们从包含受感染鸟类的隔离器中收集灰尘，并使用实时 PCR 测量灰尘中病毒基因组的浓度。在同一时间点，接种疫苗的禽类比感染相同病毒株的未接种疫苗的禽类脱落的病毒基因组拷贝数更少（图 1，中图）。这些模式反映了羽毛囊中的病毒载量（S1 图）。至关重要的是，未接种疫苗的鸟类感染我们的两种最毒株的传染期不到一周，因为宿主死亡如此之快。在那一周内，几乎没有任何病毒脱落（图 1，中图）。相比之下，最低毒力菌株的感染期在整个实验中持续（近 2 个月）。因此，与毒力毒株相比，毒力最低的毒株从未接种疫苗的禽类身上排出的病毒多几个数量级（图 1，下图）。通过防止死亡，疫苗接种大大增加了最强毒株的感染期，将病毒释放的总量增加了几个数量级，并将其增加到毒力最低的毒株之上（图 1，下图）。因此，疫苗接种对宿主存活率和每日脱落率的净影响是极大地增加了有毒株释放到环境中的病毒量。为了确认病毒释放到环境中是整体鸟对鸟传播潜力的有力代表，我们将感染了我们三种毒性最强的毒株的鸟与免疫学上幼稚的哨兵鸟一起饲养（实验 2）。当未接种疫苗的禽类感染两种最致命的毒株（Md5 和 675A）时，它们都在 10 天内死亡（图 2A），然后大量病毒开始脱落（图 S2）。因此，这些隔离器中的哨鸟没有被感染（图 2B），也没有死亡（图 2C）。相比之下，当接种 HVT 疫苗的禽类感染了这些高致病性菌株中的任何一种时，它们存活了 30 天或更长时间（图 2A），允许大量病毒脱落（S2 图）。因此，所有共同安置的哨兵都被感染（图 2B）并由于 MDV 感染而死亡（图 2C）。因此，根据不完全疫苗假说，疫苗接种使病毒能够继续传播，否则太致命而无法传播，使未接种疫苗的个体面临严重疾病和死亡的巨大风险。有趣的是，病毒株 595 的毒力略低于其他两种病毒（杀死一半未接种疫苗的鸟类需要一天的时间，而将它们全部杀死需要 6 天的时间）（图 2A）。这种略微降低的死亡率延长了未接种疫苗的鸟类的病毒脱落时间，因此 595 名感染者向环境中释放的病毒比被两种更致命毒株感染的队列多出约 100 倍（S2 图）。这显然足以传播，因为所有共同安置的哨兵最终都被感染（图 2B）并继续死亡（图 2C）。因此，致死率的轻微降低就足以允许继续传播。尽管如此，即使对于 595 菌株，接种疫苗也会导致更快速的哨兵感染（图 2B；比未接种疫苗的鸡早 9 天出现阳性的中位时间，p < 0.05），从而增加了继发病例的发生率，这是一个关键的决定因素在不断上升的流行病中病毒适应性和病例发生率的关系。我们在感染我们最毒株的未接种疫苗的鸡中观察到的高死亡率是由于早期死亡综合征，包括迅速发生麻痹、定向障碍和无法进食和移动，随后死亡 [30-33]。在当今的现代工业中，亲代禽类几乎总是接种 MDV 疫苗，这会导致母源抗体转移给雏鸡。这些抗体似乎对早期死亡综合征具有保护作用 [30-33]。这提出了一种前景，即对蛋鸡进行疫苗接种也可能允许病毒株继续传播，这些病毒株太致命而无法从后代鸟类传播。我们使用毒性最强的 (675A) 和最小的 (HPRS-B14) 毒株，再次在罗德岛红鸟中进行了进一步的实验，测试了这种可能性，但这一次包括来自在产卵前 4-5 周接种疫苗的母鸡的雏鸡标准商业 Rispens 疫苗（实验 3）。母鸡的疫苗接种提高了实验感染 HRPS-B14 的后代的存活率（图 3A，p < 0.05）。母源抗体对该病毒株在羽毛尖端的复制没有可检测到的影响（S3 图 A，p > 0.05），虽然它在某种程度上抑制了感染早期释放到环境中的传染性病毒的数量（图 3B 和S3B)，它不影响哨兵鸟类感染 HRPS-B14 的比率（图 3C，p > 0.05）并且很少有哨兵死亡（图 3D）。因此，母体保护对我们最低毒株的传播成功几乎没有影响。然而，母源抗体的存在极大地影响了最强毒株 (675A) 的传播成功。正如预期的那样，接种疫苗的母鸡的后代在感染 675A 病毒后比母源抗体阴性的小鸡存活的时间更长（图 3A，p < 0.05）。正如我们在前两个实验中发现的那样，在没有免疫保护的鸟类死亡之前，很少有高毒力菌株从它们身上脱落（图 3B 和 S3）。因此，没有哨兵被感染（图 3C）。但是具有母体保护的鸟类存活的时间更长，可以排出更多病毒（图 3A、3B 和 S3B），因此所有哨兵鸟类都被感染（图 3C）并死亡（图 3D）。母体接种疫苗的保护作用不如直接接种后代（参见图 3A 和图 2A 以及图 1 的上图）。尽管如此，蛋鸡的疫苗接种，就像后代的疫苗接种一样，能够从后代继续传播高致病性菌株（图 3C）。同样，这些数据与不完美疫苗假设一致。

我们上面的实验表明，直接给鸟类接种疫苗或给母鸡接种疫苗可以使病毒株继续传播，否则太致命而无法传播，从而使未接种疫苗的个体面临更高的严重疾病和死亡风险。然而，在现代商业肉鸡环境中，鸡群中的所有鸡都来自接种过疫苗的母鸡（因此母源抗体呈阳性），并且也接种了疫苗。因此，我们着手确定我们最毒力的菌株是否可以传播给接种疫苗的哨兵，这是现代工业中高致病性菌株持续存在的必要条件（实验 4）。为了模拟当前的商业肉鸡情况，我们获得了来自接种 Rispens 疫苗的母鸡的现代商业肉鸡，并且在 1 日龄时，我们对所有将通过实验感染的鸡进行 HVT 疫苗接种。然后这些鸟在 8 日龄时感染了我们毒性最强的病毒株 (675A)。我们将那些实验感染的鸟类与哨兵鸟一起饲养，这些鸟要么接种了 HVT，要么没有。我们进行了两次这个实验。为了适应不断变化的监管要求（参见方法），我们对饲养在隔离器中的鸡进行了第一次重复，直到 35 天龄，然后将它们移到地板上直到它们 11 周大（实验 4a），第二次对鸡进行重复从 1 天龄到 7 周龄（实验 4b）保持在地笔中。无论疫苗状态如何，所有哨兵都被感染（图 4A）。因此，接种过疫苗的母源抗体阳性的商业鸟类会散发出野生型病毒，该病毒在接种过疫苗和未接种过疫苗的母体抗体阳性鸟类中都会引起感染。在哨兵鸟类获得的感染中，接种疫苗仅略微抑制病毒复制（图 4B）。重要的是，所有接种疫苗和未接种疫苗的哨兵毛囊中的病毒都呈阳性，这意味着它们本身开始脱落。疫苗接种保护哨兵鸟类免于死亡（图 4C），将感染期延长约 2 周（图 4D；差异标准误差 ±3.2 天，F 1,36 = 19.9，p < 0.0001）。因此，当现代商业肉鸡接种疫苗时，我们的毒性最强的菌株不仅会在它们之间传播，而且传播链中下一步的脱落持续时间也因疫苗接种而增加。 MDV 在 20 世纪下半叶变得越来越具有毒性 [19, 21–24]。直到 1950 年代，在家禽养殖场中传播的 MDV 菌株引起了轻度麻痹性疾病，其病变主要局限于周围神经组织。死亡相对较少。今天，全世界都存在高致病性菌株。这些菌株会在各种器官中诱发淋巴瘤，未接种疫苗的鸟类死亡率高达 100%。就我们所知，没有人能够从当今的商业（接种）家禽操作中分离出非致死性 MDV 毒株 [19, 23]。究竟是什么促进了这种病毒进化尚不清楚。越来越多的毒力病毒株已经克服了越来越有效的疫苗这一观察结果促使许多 MDV 专家提出疫苗接种可能是一个关键驱动因素 [19-24, 34-37]，尽管确定所涉及的进化压力已被证明具有挑战性。在马立克氏病中没有证据表明更强毒株的疫苗突破与克服菌株特异性免疫（例如表位进化）有任何关系；毒力不同菌株的遗传和免疫学比较表明候选毒力决定因素与宿主细胞相互作用和病毒复制有关，而不是抗原 [19]。不完全疫苗假说被认为是一种进化机制，免疫可能通过该机制驱动 MDV 毒力进化 [2]，但没有实验证实。我们的数据表明：通过提高宿主存活率但不能阻止病毒脱落，母鸡或后代的 MDV 疫苗接种大大延长了高致病性毒株的感染期，从而延长了它们进入环境的病毒量。我们的数据并未证明疫苗接种是导致 MDV 高致病性毒株进化的原因，而且我们可能永远无法确定它们最初进化的原因。显然，随着家禽业的集约化，许多潜在相关的毒力生态压力发生了变化。例如，随着行业的扩大，肉鸡已成为该行业的重要组成部分，随着动物遗传学和畜牧业的进步，肉鸡的寿命缩短了一半；在所有其他条件相同的情况下，这将有利于更具毒性的菌株 [28]，因此也可能提高鸡群中的遗传同质性 [38] 或高密度饲养条件 [13]，或者如果自然 MDV 感染变得更多，则母源抗体的频率确实会增加随着该行业在疫苗出现前时代的加强，这很常见（图 3）[39]。但是，无论最初是导致毒性更强的菌株进化的原因是什么（可能有很多原因），我们的数据表明，今天接种疫苗足以维持家禽群中的高致病性菌株。通过使受感染的鸟类保持存活，疫苗接种大大提高了传播成功率，从而大大提高了病毒株的传播率，这些病毒株太致命而无法在未接种疫苗的种群中持续存在，因此在接种疫苗之前的时代，这些病毒株会被自然选择消除。我们的实验揭示了针对高致病性菌株的自然选择的放松是因为疫苗接种提高了宿主的存活率。在啮齿动物疟疾的连续传代实验中，由全寄生虫免疫 [40] 或接种重组抗原 [10] 诱导的免疫也促进了毒力的进化。然而，按照设计，这些实验不允许宿主死亡影响病原体的适应性，因此以不同的方式推动了毒力增强的进化。显然，该系统中的免疫对于毒性较低的菌株的效率不成比例。我们的 MDV 实验并非旨在测试宿主内选择，但有一些建议表明疫苗诱导的免疫可以更好地控制最低毒力菌株的复制（图 1 和 S1）。原则上，这两种进化压力（宿主内选择有利于毒力变异体逃避免疫的能力和疫苗诱导的宿主间抗毒力选择的放松）可以共同产生对更具毒性的菌株的非常有效的选择 [4]。菌株之间的宿主内竞争可以增加对更高毒力的进一步选择 [41, 42]。至少有两种病毒（MDV 除外）：猫杯状病毒 [43] 和家禽传染性法氏囊病病毒 [44]，疫苗在面对强毒病原体时失败。这两种情况也与长期使用渗漏型抗病疫苗有关。我们的数据也与旨在解释两个经过充分研究的野生动物系统毒力增加的假设一致。首先，北美家雀中的家禽病原体鸡毒支原体菌株变得越来越毒力，这可能是由于 1990 年代该细菌在雀类种群中出现后部分免疫鸟类的发病率增加 [45]。二、经过完善的文档......