新冠肺炎患者样本中嗅觉犬鉴定的初步研究

随着新冠肺炎疫情的持续蔓延，及早、最好是实时地识别SARS-CoV-2感染者是中断感染链的关键。呼吸道感染期间产生的挥发性有机化合物会造成特殊的气味印记，训练有素的狗可以很高的准确率检测到这一点。

在一项随机、双盲、对照的研究中，8只检测犬接受了为期1周的训练，以检测SARS-CoV-2感染患者的唾液或气管支气管分泌物。

犬对感染(阳性)和未感染(阴性)个体样本的平均诊断敏感性为82.63%(95%可信区间：82.02-83.24%)，特异性为96.35%(95%可信区间：96.31-96.39%)。在1012个随机样本的展示过程中，狗的总体平均检出率为94%(±3.4%)，其中157个正确的阳性指示，792个正确的阴性拒绝，33个错误的阴性指示或30个阳性样本的错误拒绝。

这些初步研究结果显示，受过训练的侦测犬可通过区分SARS-CoV-2感染者和阴性对照的样本，识别住院和临床患病的SARS-CoV-2感染者的呼吸道分泌物样本。该数据可为建立可靠的SARS-CoV-2感染者筛查方法提供依据。

正在进行的新冠肺炎大流行突出了快速和可靠的检测对于准确识别有症状和无症状的携带者以有效减少感染传播的重要性[1]。目前的检测方案通常需要训练有素的人用鼻咽拭子和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来鉴定病原体。获得RTPCR结果既耗时又昂贵，特别是对发展中国家来说，因此目前经常以有针对性的方式使用，主要检测具有新冠肺炎特异性症状的患者[1]。因此，需要一种额外的更快、可靠、非侵入性和多功能的筛查工具，特别是用来识别无症状和无症状的个体。

几项研究已经证明，犬类具有非凡的嗅觉敏锐性，可以检测患有感染性和非传染性疾病的人，如不同类型的癌症[2]、疟疾[3]、细菌感染和病毒感染[4、5、6]，通常灵敏度和特异度都很高[7]。狗可以检测到的病原体特异性气味可能由挥发性有机化合物(VOCs)的特定模式组成。与细菌相比，病毒没有自身的新陈代谢，因此被感染的身体细胞通过新陈代谢宿主过程释放VOCs[8]。不同的技术方法已经成功地使用VOCs的检测来区分感染性疾病，但没有一种技术方法在临床实践中被常规使用[9]。由于狗可以快速训练，本研究的目的是测试使用狗可靠和实时地区分SARS-CoV-2感染患者样本和非感染对照样本的概念。这种方法可用于机场、体育赛事、边境或其他大规模集会等公共场所，作为实验室检测的替代或补充，从而有助于防止病毒进一步传播或进一步爆发。

收集新冠肺炎住院患者的唾液和气管、支气管分泌物标本，经鼻咽拭子拭子检测，确诊为SARS-CoV2阳性。阴性对照样本来自SARS-CoV2RTPCR阴性者，既无新冠肺炎病史，也无近期感冒或感染史。没有对不同的人类冠状病毒进行筛查，如β冠状病毒HCoV-OC43或α冠状病毒HCoV-229E。样本采集后，匿名样本被运送到汉诺威兽医大学。

所有收集的样本均经巴斯德研究所的RT-PCR SARS-CoV-2-IP4检测确认为阳性或阴性(由世界卫生组织推荐[10，11]，包括所述的内部控制系统和方案[12，13])。对新冠肺炎患者标本(无论最终RTPCR结果如何)进一步进行病毒定量(终点稀释法)，并在生物安全3级条件下用VEROE6细胞进行病毒分离分析。检测细胞层的细胞病变效应，并在细胞感染后7天得出最终结果。由于犬对SARS-CoV-2易感[14]，所有来自新冠肺炎患者的样本均用β-丙内酯灭活，以保护犬及其饲养员在训练过程中免受感染。简单地说，样品和试剂保存在4 °C，加入2 0 μl/ml NaHCO3(7.5%)，

对于训犬，每个样本100 μl的体积被输送到棉垫上，棉垫被放入4 ml的玻璃管中。

样品的展示是通过一种名为检测犬训练系统(DDTS；KynoScience UG，德国)的设备进行的，该系统可以在没有训练员干预的情况下以随机的自动方式展示样品。有关短视频序列，请参阅附加文件：1。DDTS用于培训和测试。该装置由七个气味孔组成。在每个孔的后面，有两根管子通向两个金属容器。在研究中，第一个容器包装目标样品，第二个容器装载对照样品。在任何给定时间，由于成对的容器位于装置内部的可移动滑块上，所以在每个嗅探孔中仅呈现一个容器。金属容器上覆盖着栅格，这样气味就可以逸出，到达嗅探孔。每个试管延伸部都是相同的，呈L形，这防止了狗与样本的身体接触，并排除了任何可能使进一步的检测能力成为可能的视觉线索。在每一次试运行中，只有一个孔一次呈现SARS-CoV-2阳性样本，而其他六个孔呈现阴性样本。在用阳性样本指示洞口后，装置会自动奖励狗食物或球。在成功训练的过程中，指示时间从1s改为2s。当奖励被吃掉时，该设备的软件随机并自动地为下一阶段的幻灯片分配新的位置，再次只有一个洞呈现阳性气味样本。

这只狗、它的训导员和一名观察这项研究的人在双盲研究期间被蒙蔽了双眼。在试跑过程中，所有人员都站在狗的后面，以避免分心。该装置自动记录每个鼻孔浸入气味孔的次数和时间长度，以及阳性和阴性样品的位置。这通过手动时间戳视频分析进行了验证。

根据Trevethan[15]计算诊断敏感性(Se = 真阳性(‘Tp’)/[Tp + 假阴性(‘Fn’)])、诊断特异性(Sp = 真阴性(‘Tn’)/[Tn + 假阳性(‘Fp’)])、阳性预测值(PPV = Tp/[Tp + FP])和阴性预测值(Npv = Tn/[Tn + Fn])。

在对DDTS进行了2周的习服过程后，这8只狗总共需要5天的训练，直到发现率超过机会。额外的电子表格提供了研究中使用的狗的背景信息(参见额外的文件2)。然后在7天的培训后进行对照双盲检测研究，总共10,388个样本陈述(表1)。

在每个训练日，向犬赠送未知和已知的阳性样本和阴性对照样本。使用对新样本的响应来评估是否已经实现了泛化过程。虽然狗只在训练的第二天达到了50%的平均检测率，但在第五天，这些值增加到了70%，在第七天甚至达到了81%，这表明概括过程是成功的。训练过程完成后，在随机、双盲和对照研究中对8只训练犬的检测准确性进行了评估(表2)。本研究使用了7名感染者和7名健康人的样本。阳性标本中有2例为气管支气管分泌物，另1例为唾液。

在随机和自动提交的1012个样本中，狗的总体平均检测率为94%(±3.4%)，其中157个正确指示为阳性，792个正确拒绝阴性，33个假阳性和30个假阴性指示。犬对感染和未感染个体的总诊断灵敏度为82.63%(95%可信区间：82.02-83.24%)，特异性为96.35%(95%可信区间：96.31-96.39%)。敏感度为67.9%~95.2%，特异度为92.4%~98.9%(图1)。唾液和气管分泌物的检测能力无显著性差异(平均符合率分别为85.1%和87.7%)。

狗的诊断特异性和敏感度，以及对所有狗的诊断特异性和敏感度。胡须显示95%的置信区间

及时、准确地检测出SARS-CoV-2感染者对社会控制疫情至关重要。我们的数据表明，侦查犬可以在大约一周的时间内接受训练，以区分感染和未感染SARS-CoV-2的人的样本。平均检出率为94%。准确度和精密度分析显示，所有犬的诊断敏感性为82.63%(95%CI：82.02-83.24%)，诊断特异性为96.35%(95%CI：96.31-96.39%)。所有犬均具有较高的诊断特异性和较小的变异范围，这对人群筛查避免假阳性结果具有重要意义。然而，个体狗和狗之间的敏感度有相当大的差异。这在一定程度上可以用狗的不同训练背景(见附加文件2)、信号、个性特征和7天的短期训练来解释。为了避免对医院特有气味的偏见，从两家不同的医院获得了阳性样本，以包括协变量因素的变异，这似乎没有影响目前的结果。在考虑在现场使用探测犬之前，更好地了解为什么会有这样的灵敏度范围以及如何潜在地提高灵敏度是很重要的。相比之下，目前诊断鼻咽拭子的金标准RT-PCR检测，在训练有素的人手中，假检测率为25%，假阳性率为2.3%-6.9%[16]。一项新的尚未发表的研究使用呼吸的多毛细管柱耦合离子迁移率光谱法显示，与阴性对照和流感病毒感染者相比，SARS-COV-2感染者具有清晰的、几乎100%的VOC特异性模式[17]。这进一步表明存在独特的VOC印迹，并可用于开发诊断程序。

目前的研究结果是可喜的，但应认为是初步的，该检测方法在现场的适用性有待进一步研究才能获得。我们的工作为开发一种新的SARS-CoV-2筛查方法提供了第一步。我们收集的样本的纳入标准是相当不特定的，并且没有根据症状的严重程度、疾病状况或病毒载量进行分层。今后需要进行更多不同的研究，包括增加不同样本的数量，以评估分析的敏感性(例如样本稀释/检测水平、不同的疾病表型和阶段)和分析的特异性(鉴别其他肺部疾病或病原体，如癌症，或与其他季节性呼吸道病毒感染，如流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒，而不是SARS-CoV-2冠状病毒、鼻病毒的感染)。在目前的研究中，阴性对照样本取自没有呼吸道疾病临床症状的健康个体。这些人只接受了SARS-CoV-2病毒的检测，因此不能排除以前的感染，特别是另一种人类冠状病毒，如HCoV-OC43，导致了狗的假阳性迹象，并发生了交叉检测。另一方面，当前研究中包括的样本来自受严重影响的住院新冠肺炎患者，但控制当前大流行的主要挑战之一是识别出有症状前的新冠肺炎患者和无症状的携带者，这可能构成大多数新冠肺炎病例[18]。犬只检测的敏感度也可能在整个疾病过程中有所不同。因此，未来的研究应该集中在狗识别新冠肺炎病的不同表型和疾病表现阶段的能力，如无症状、无症状、轻度和严重的临床病例，以及在疾病过程中的不同时间点测试同一个体的样本的能力。

处理感染样本的最重要要求之一是感染预防和控制。最初，人们认为狗不会感染SARS-CoV-2，但最近的单一病例报告表明，狗可以感染SARS-CoV-2，并可能在病毒传播中发挥作用[14，19]。有证据表明，人与动物之间的传播与随后的狗感染有关。目前还不清楚狗是否可以通过感染其他动物或人类而起到病毒传播者的作用[14，20]。然而，当使用狗来检测受感染的物质或人时，需要考虑这一点。目前也不清楚狗的感染会如何改变它的嗅觉。在目前的研究中，我们选择使用一种不应影响VOCs的失活程序。然而，这对于现场测试是不现实的，我们目前正在开发新的策略，以安全地展示未灭活的样品。这将消除病毒传播的潜在风险

4.Taylor M，McCady J，Broukhanski G，Kirpalaney S，Lutz H，Powis J.使用狗味检测作为一种护理点工具来鉴定粪便中的产毒难辨梭菌。开放论坛感染DIS。2018年；5：1-4。

5.角度C，Waggoner LP，Ferrando A，Haney P，Passler T.Canine对挥发物组的检测：对病原体和疾病检测的意义的综述。前排兽医科学。2016；3：1-7。

6.ANGLE TC，Passler T，Waggoner PL，Fischer TD，Rogers B，Galik PK等。使用检测犬实时检测病毒。前面。兽医。SCI。2016；2：1-6。

7.Koivusalo M，Reeve C.生物医学嗅觉探测犬：它们会被认为是一项健康技术吗？宠物行为科学。2018年；6：1-7。

8.Amann A，Costello BDL，Miekich W，Schubert J，Buszewski B，Pleil J等人。人体挥发物：呼气、皮肤分泌物、尿液、粪便和唾液中的挥发性有机化合物(VOC)。J呼吸研究，2014年。Https://doi.org/10.1088/1752-7155/8/3/034001.。

9.Shirasu M，Touhara K.疾病的气味：人体内与疾病和紊乱有关的挥发性有机化合物。生物化学。2011；150(3)：257-66。

10.巴斯德研究所(Institut Pasteur)，巴黎。方法：实时定量RT-PCR检测SARS-CoV-2。2020年3月可从：https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2.访问2020年3月31日。

11.事件S，Bal A，Escurret V，Brengel-Pesce K，Bouscambert M，Cheynet V等。世卫组织转诊实验室SARS-CoV-2 PCR检测的敏感性评价。MedRxiv 2020.05.03.20072207；https://doi.org/10.1101/2020.05.03.20072207.

13.Hoffmann B，Depner K，Schirrmeier H，Beer M。双重实时RT-PCR检测系统中使用的通用异源内控系统。J Virol方法。2006；136：200-9。

14.Sit THC，Brackmann CJ，Ip SM，Tam Kws，Law PYT，to EMW等人。犬的ARS-CoV-2感染。《自然》2020年；https://doi.org/10.1038/s41586-020-2334-5(2020年)。

15.Trevethan R.敏感性、特异性和预测值：研究和实践中的基础、责任和陷阱。前台酒吧健康中心。2017年；5：307。Https://doi.org/10.3389/fpubh.2017.00307.。

16.科恩·安(Cohen An)，Kessel B.2020。SARS-CoV-2逆转录聚合酶链反应检测中的假阳性。MedRxiv；doi：https://doi.org/10.1101/2020.04.26.20080911.。

17.Steppert C，Steppert I，Becher G，Sterlacci W，Bollinger T.2020。呼吸多毛细管柱耦合离子迁移率光谱法(MCC-IMS)快速检测SARS-CoV-2感染。概念研究的证明MedRxiv；doi：https://doi.org/10.1101/2020.06.30.20143347.。

18.Riley S，Ainslee KEC，Eales O，Jeffrey B，Walter CE，Atchison C等。2020年。2020年5月英国sars-cov-2病毒社区流行情况：反应研究。MedRxiv；https://doi.org/10.1101/2020.07.10.20150524.。

19.Leroy EM，Gouilh MA，Brugère-Picoux J.非典型肺炎冠状病毒向宠物和其他野生和家养动物传播的风险强烈要求采取单一卫生战略来控制新冠肺炎大流行。One Health(一个健康)。2020年。Https://doi.org/10.1016/j.onehlt.2020.100133.。

20.史军，文正，钟刚，杨华，王超，黄斌，等。磁化率

.