氯喹是SARS冠状病毒感染和传播的有效抑制剂(2005)

1特殊病原体分部，美国佐治亚州亚特兰大市克利夫顿路1600号，疾病控制和预防中心病毒和立克次体疾病部，邮编：30333。

2加拿大蒙特利尔临床研究所生化神经内分泌学实验室，蒙特利尔松树大道西110号，邮编：QCH2W1R7。

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严重急性呼吸综合征(SARS)是由一种新发现的冠状病毒(SARS-CoV)引起的。目前还没有有效的预防或暴露后治疗方法。

然而，我们报道氯喹对灵长类细胞的SARS-CoV感染有很强的抗病毒作用。当细胞在接触病毒之前或之后用药物处理时，可以观察到这些抑制作用，这表明了预防和治疗的优势。氯喹除了具有提高细胞内膜pH等众所周知的作用外，还可干扰细胞受体--血管紧张素转换酶2的末端糖基化，这可能会对病毒与受体的结合产生负面影响，从而消除感染，进一步通过提高囊泡pH，在临床可接受的浓度下抑制SARS冠状病毒的感染和传播，从而抑制SARS冠状病毒的感染和传播，这是氯喹的另一个众所周知的作用，它可能会干扰细胞受体-血管紧张素转换酶2的末端糖基化，从而对病毒与受体的结合产生负面影响，从而消除感染。

氯喹能有效地防止SARS冠状病毒在细胞培养中的传播。在SARS冠状病毒感染前或感染后用氯喹处理细胞，均能较好地抑制病毒传播。此外，本文描述的间接免疫荧光法是筛选SARS冠状病毒抗病毒化合物的一种简单而快速的方法。

严重急性呼吸综合征(SARS)是我国广东省于2002年底首次报道的一种新发疾病。这种疾病在首次出现后的几个月内迅速传播到至少30个国家，全球范围内的共同努力导致了对SARS冠状病毒(SARS-CoV)的确认，SARS冠状病毒是冠状病毒科的一个新成员[]。SARS-CoV[，]的完整基因组测序证实，这种病原体与之前建立的任何冠状病毒群都没有密切的关系。SARS冠状病毒的萌发发生在高尔基体[]，并导致包膜刺状糖蛋白被合并到病毒粒子中。S蛋白是一种I型膜蛋白，可促进病毒与细胞受体的粘附和启动感染，血管紧张素转换酶-2(ACE2)已被确定为SARS-CoV的功能性细胞受体[]。我们最近已经证明，刺突蛋白的加工是由呋喃类转化酶影响的，并且用一种特定的抑制剂抑制这种切割可以消除细胞致病性，并显著降低SARS-CoV的病毒滴度[]。

由于SARS-CoV感染的严重性，疾病快速传播的潜力，以及缺乏被证明有效和安全的体内病毒抑制剂，因此确定能够有效用于治疗或预防潜在的SARS-CoV感染的药物是很重要的。在实验室研究中评价了许多新的治疗方法：其中值得注意的是使用siRNA[]、被动抗体转移[]、DNA疫苗[]、表达刺突蛋白[，]、干扰素[，]的痘苗或副流感病毒，以及针对阻断受体结合的刺突糖蛋白S1亚基的单克隆抗体的治疗方法[]，其中值得注意的是使用siRNA[]、被动抗体转移[]、DNA疫苗接种[]、表达刺激性蛋白[，]、干扰素[，]以及针对阻断受体结合的刺激性糖蛋白S1亚单位的单克隆抗体。在这份报告中，我们描述了氯喹作为一种有效的SARS冠状病毒感染前和感染后的抗病毒药物的鉴定。氯喹是1934年发现的一种9-氨基喹啉，是一种能增加酸性囊泡pH值的弱碱。当细胞外加入时，氯喹的非质子化部分进入细胞，在那里它变得质子化，并集中在酸性的、低pH的细胞器中，如内体、高尔基囊泡和溶酶体。氯喹可以通过多种方式影响病毒感染，其抗病毒效果部分取决于病毒利用内体进入的程度。氯喹已被广泛用于治疗人类疾病，如疟疾、阿米巴病、艾滋病病毒和自身免疫性疾病，没有明显的不良副作用[]。再加上这里提供的数据，显示氯喹在细胞培养中的病毒抑制作用与患者治疗相适应，这些特征表明，随着我们在寻找有效的抗病毒药物来预防或治疗这种疾病方面的进展，在SARS-CoV感染的动物模型中进一步评估氯喹是有必要的。

为探讨氯喹是否具有预防SARS冠状病毒感染的作用，在病毒感染前用不同浓度的氯喹(0.1~10μM)预处理VERO E6细胞2 0~2 4h。然后用SARS-CoV感染细胞，用间接免疫荧光法显示病毒抗原，如“材料和方法”中所述。显微镜检查(图2)。​(图1A)1A)对照细胞(未处理，感染

电镜分析显示，感染后5-6h出现了大量的胞外病毒颗粒[]。由于我们在病毒吸附后立即观察到氯喹的抗病毒作用，我们进一步扩大了分析范围，在病毒吸附后3小时和5小时加入氯喹，并在20小时后检查病毒抗原的存在，发现即使在感染后5小时加入氯喹仍有显著的效果(图3)。​(图3)；3)；然而，为了获得同等的抗病毒效果，如果药物在吸附后3或5小时后加入，则需要较高浓度的氯喹。

由于氯喹在感染前或感染后都能抑制SARS冠状病毒的感染，我们推测另一种常见的溶酶体促进剂NH4Cl可能也有类似的作用方式。氯化铵已被广泛应用于解决内体介导的病毒进入的研究中。巧合的是，最近发现NH4Cl能减少SARS冠状病毒刺突蛋白修饰的假型病毒的转导[，]。为了检查NH4Cl的功能是否类似于氯喹，我们在之前的Vero E6细胞中进行了感染分析(图2)。​(图4A)4A)和之后(图4A。​(图4B)4B)，用不同浓度的NH4Cl处理。在这两种情况下，我们观察到在≥为5 mM处用NH4Cl的抑制率为93-99%。提示NH4Cl(≥5 mM)和氯喹(≥10μM)对降低SARS冠状病毒感染有很好的效果。这些结果提示氯喹和NH4Cl控制SARS冠状病毒感染和传播的作用可能是通过相似的机制介导的。

我们还进行了额外的实验，以阐明氯喹和NH4Cl抑制SARS-CoV的机制。由于囊泡内酸性pH调节细胞功能，包括N-糖基化修剪、细胞转运和各种酶活性，因此研究这两种药物对SARS-CoV刺激性糖蛋白及其受体ACE2的加工、糖基化和细胞分选的影响是很有意义的。流式细胞术分析未经处理或经高效抗SARS-CoV浓度的氯喹或NH4Cl处理的Vero E6细胞。结果表明，这两种药物都没有引起细胞表面ACE2水平的显著变化，表明观察到的抑制SARS-CoV感染的作用不是由于缺乏有效的细胞表面ACE2(图2)。​(图5A)。5A)。然后，我们分析了未处理的VeroE6细胞和不同浓度的NH4Cl(2.5~10 mM)或氯喹(1和10μM)预先孵育1h，并在药物存在或不存在的情况下用35S-(Met)标记3h的细胞中内源性ACE2的分子形式。​(图5B、5B和​和5C)。5C)。在正常条件下，我们观察到两种免疫反应阳性的ACE2形式，分别在~105和~113 kDa处迁移。​(图5B，5B，通道1)。~105 kDa蛋白对内糖苷酶H敏感，提示它代表内质网(ER)定位形式，而~113 kDa蛋白对内糖苷酶H敏感，代表ACE2[]的高尔基修饰形式。用过量的冷溶人重组ACE2(+rhACE2；图2)置换免疫反应蛋白条带，证实了抗体的特异性。​图5B、5B，通道2)。当我们分析在NH4Cl存在下的ACE2形式时，随着NH4Cl浓度的增加，~113 kDa蛋白的迁移明显增加，在10 mM NH4Cl时效果最大，导致凝胶上只有ER形式的ACE2可见(图2)。​(图5B，5B，比较通道3-5)。这表明NH4Cl处理影响了ACE2的N-糖基化链的修剪和/或末端修饰。此外，在10 mM NH4Cl作用下，ACE2的ER形式迁移速度稍快，提示该浓度的NH4Cl也可能影响核心糖基化。我们还检测了氯喹处理细胞时ACE2的末端糖基化状态(图3)。​(图5C)。5C)。与NH4Cl相似，ACE2的电泳迁移率随氯喹浓度的增加而逐渐增大。在25μM氯喹时，高尔基修饰的ACE2的电泳迁移率明显提高。根据流式细胞术和免疫沉淀分析，可以推断NH4Cl和氯喹均可损伤ACE2的末端糖基化，而NH4Cl的作用更为显著。虽然ACE2在细胞表面的表达量相近，但其糖基化状态的变化可能会降低ACE2-SARS-CoV相互作用的效率，并在NH4Cl和氯喹处理细胞时抑制病毒入侵。

确认ACE2经过末端糖修饰，末端糖基化受

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